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Navegando Tese por Orientador(a) "Barchuk, Angel Roberto"

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Aspectos morfológicos e moleculares do desenvolvimento cerebral casta-específico em Apis mellifera
    (Universidade Federal de Alfenas, 2019-10-30) Paula Junior, Delcio Eustaquio De; Barchuk, Angel Roberto; Soncini, Roseli; Simões, Zilá Luz Paulinho; Lourenço, Anete Pedro; Kalil, Bruna
    As abelhas Apis mellifera são insetos conhecidos por sua eussociabilidade. Os adultos da espécie; zangões, rainhas e operárias, exibem nítida divisão de trabalho e sobreposição de gerações. Rainhas e operárias são um clássico exemplo de difenismo, o qual é determinado pela alimentação diferencial, geleia real ou geleia de operária, recebida entre o terceiro e quinto ínstar larval. A alimentação influencia o desenvolvimento cerebral em muitas espécies, inclusive em A. mellifera, que apresenta morfogênese cerebral diferencial entre rainhas e operárias. Durante o período larval o cérebro de rainhas mostra-se maior, com maior número de neuroblastos e também com maior taxa de proliferação celular. Todavia, é sabido que o cérebro adulto de operárias é proporcionalmente maior do que o de rainhas, deste modo, hipotetiza-se que ocorra uma inversão do tamanho cerebral durante o desenvolvimento pupal e/ou adulto-farato por intermédio da ação de genes hormonalmente modulados. Foram identificados, por meio de microarranjos de oligonucleotídeos, um conjunto de genes diferencialmente expressos no cérebro rainhas e operárias Pp, dentre os quais podem estar genes primordiais para o desenvolvimento cerebral casta específico. Assim, objetivou-se determinar a dinâmica morfológica e as bases moleculares do desenvolvimento cerebral durante o período pupal e adulto-farato em rainhas e operárias. Os resultados mostraram que o cérebro de operárias se desenvolve mais do que o de rainhas no período pupal e meados do desenvolvimento adulto-farto. Os corpos cogumelares e pedunculares ocupam maior área no cérebro de operárias e há lateralização anatômica relacionada a essas estruturas no cérebro de ambas as castas. Em busca dos determinantes moleculares da morfogênese cerebral, analisamos a expressão de 17 transcritos, tum, mnb, ATPsynβ, ant, InR-1, InR-2, ILP-1, ILP-2, Tor, hex 70a, hex70b, hex 110, lncov-1, LOC 726407, caspase-1, EcR-A e EcR-B, e verificamos que apenas hex 110 não é diferencialmente expressa entre as castas. Analisamos a resposta de 8 (tum, mnb, ATPsynβ, ant, ILP-1, ILP-2, lncov-1e caspase-1) deles aos hormônios HJ e 20E. Todos respondem a pelo menos um dos hormônios. Ademais, imunolocalizamos os produtos proteicos dos genes ATPsynβ e hex 70a e observamos que o primeiro apresenta localização citoplasmática e o segundo citoplasmática e nuclear. Em conjunto, nossos resultados permitem supor que o ambiente hormonal, mais especificamente os altos títulos de ecdisteroides, é interpretado de forma diferencial no cérebro de rainhas e operárias, gerando diferenças no padrão de expressão gênica que favorecem o desenvolvimento do cerebral em operárias. Ensaio de RNAi estão em andamento e verificarão os efeitos do silenciamento pós-transcricional de mnb, um gene que parece protagonizar o processo de morfogênese cerebral diferencial em A. mellifera durante o período pupal e aduto-farato.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Biologia molecular da morfogênese diferencial inicial do cérebro em castas de abelhas Apis mellifera
    (Universidade Federal de Alfenas, 2020-03-02) Vieira, Joseana; Barchuk, Angel Roberto; Dias, Marcos Vinicios Salles; Nunes, Francis De Morais Franco; Rodrigues, Pedro Augusto Da Pos; Martins, Juliana Ramos
    O desenvolvimento do cérebro é influenciado por fatores genéticos e ambientais. As larvas de rainhas de abelhas Apis mellifera que são alimentadas com grandes quantidades de geleia real, experimentam maior e mais rápido desenvolvimento do cérebro do que as operárias. A hipótese do cérebro social propõe que, evolutivamente, as diferenças de castas nas abelhas foram promovidas por trade-offs morfofisiológicos do desenvolvimento em que a casta especializada na reprodução investe no desenvolvimento dos ovários, enquanto que as operárias, não reprodutivas, investem no desenvolvimento do cérebro, o que foi confirmado em A. mellifera. Desde o ponto de vista genômico, as espécies de abelhas mais sociais deveriam possuir uma proporção maior de genes neurogênicos, comparada à encontrada no Homo sapiens, com espécies solitárias com proporções menores. O difenismo cerebral de A. mellifera fica evidente do ponto de vista morfológico a partir do 4º estágio larval, porém, molecularmente, a diferença já está presente no 3º estágio larval (L3). Utilizando seqüenciamento de nova geração (RNA-Seq) identificamos 60 genes diferencialmente expressos (GDEs) nos cérebros de L3, que devem incluir genes primordiais para o desenvolvimento cerebral casta-específico. O presente trabalho objetivou determinar os alcances da participação destes genes na morfogênese diferencial inicial do cérebro entre as castas e testar a hipótese do cérebro social entre 11 espécies de abelhas. As análises comparativas de genes neurogênicos entre estas abelhas (incluindo A. mellifera), Drosophila e Homo sapiens não refletiram uma associação entre proporção destes genes e o nível de socialidade em insetos. Em busca dos determinantes moleculares da morfogênese cerebral diferencial, validamos a expressão de nove GDEs (amd, amci, forked, hex70b, hex70c, hex110, mas, nt-1 e takeout) durante o período larval de ambas castas. Para determinar a eventual participação de miRNAs (miRNAs miR-317, miR-34 e miR-210) na regulação da expressão desses genes usamos ferramentas in silico e ensaios de luciferase. Todos os GDEs estudados respondem a pelo menos um dos miRNAs, exceto amd. Ademais, imunolocalizamos o produto proteico do gene hex110 e observamos que apresenta localização nuclear. Estes resultados mostram que o estabelecimento do dimorfismo cerebral se inicia em L3, momento em que a alimentação das larvas se torna casta-específica, mediante a expressão gênica diferencial regulada pelos miRNAs miR-317, miR-34 e miR-210.
    Brain development is influenced by genetic and environmental factors. The larvae of Apis mellifera queens, which are fed with large amounts of royal jelly, experience greater and faster brain development than workers. The social brain hypothesis suggests that, evolutionarily, the differences in castes in bees were promoted by morphophysiological development trade-offs in which the caste specialized in reproduction invests in the development of the ovaries, while the workers, non-reproductive, invest in the development of the brain, which has been confirmed in A. mellifera. From a genomic point of view, highly social bee species should have a higher proportion of neurogenic genes, compared to that found in Homo sapiens, whereas solitary species should have smaller proportions. The brain diphenism of A. mellifera is evident from the morphological point of view from the 4th larval stage, however, molecularly, the difference is already present in the 3rd larval stage (L3). Using next generation sequencing (RNA-Seq) we identified 60 differentially expressed genes (DEGs) in L3 brains, which must include genes primordial for castespecific brain development. The present work aimed to determine the scope of the participation of these genes in the initial differential morphogenesis of the brain between the castes and to test the social brain hypothesis among 11 species of bees. Comparative analyses of neurogenic genes among these bees (including A. mellifera), Drosophila and Homo sapiens did not reflect an association between the proportion of these genes and the level of sociality in insects. In search of the molecular determinants of differential brain morphogenesis, we validated the expression of nine DEGs (amd, amci, forked, hex70b, hex70c, hex110, mas, nt-1 and takeout) during the larval period of both castes. To determine the possible participation of miRNAs (miRNAs miR-317, miR-34 and miR-210) in the regulation of the expression of these genes, we use in silico tools and luciferase assays. All studied DEGs respond to at least one of the miRNAs, except amd. In addition, we immunolocalize the protein product of the hex110 gene and observe that it has a nuclear location. These results show that the establishment of brain dimorphism starts at L3, at which point the larval feed becomes caste-specific, through differential gene expression regulated by miRNAs miR-317, miR-34 and miR-210.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Fatores envolvidos na escolha do hospedeiro pelo caruncho do feijão: Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)
    (Universidade Federal de Alfenas, 2021-06-07) Capizzani, Bianca Corrêa; Barchuk, Angel Roberto; Soncini, Roseli; Nascimento, Fábio Santos Do; Nascimento, Luana Beatriz Dos Santos; Simôes, Zila Luz Paulino
    O comportamento de oviposição, comum em espécies endofíticas, determina a dieta de muitos insetos. É o caso do caruncho Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Chrisomelidae: Bruchinae), membro da subfamília Bruchinae, considerado uma das maiores pragas do feijão estocado em armazéns, pois deposita seus ovos e se alimenta de várias espécies de Leguminosae. Trabalhos recentes demonstram que há uma hierarquia na escolha do grão que servirá como alimento para seus descendentes, sendo: feijão > soja > lentilha ≥ grão de bico. No entanto, os fatores que determinam essa escolha ainda são desconhecidos, mesmo sendo de grande importância para a agricultura e a economia. Várias características das sementes podem ser responsáveis por determinar esta escolha. Porém, o fator determinante deve ser percebido pela fêmea antes de ovipositar. O tamanho e a textura da semente não parecem ser determinantes. Neste trabalho testamos a hipótese de que compostos voléteis emanados pelas sementes são os determinantes da escolha de hospedeiro por fêmeas de Z. subfasciatus. Para isso, objetivamos (a) identificar os compostos voláteis que são emanados por diferentes grãos (feijão, soja, lentilha e grão de bico) e reconhecidos pelas fêmeas durante o período de ronda, prévio à oviposição; (b) e analisar a participação das antenas no reconhecimento destas substâncias através da comparação entre fêmeas e machos. Inicialmente, fêmeas de Z. subfasciatus de até 24 h de idade foram colocadas em uma arena de escolha para testes múltiplos simultâneos. Em 4 placas de petri periféricas, foram colocados um tipo de grão (lentilha, soja, feijão ou grão de bico) por placa; a quinta placa ficou vazia (controle). Sendo assim, foram realizados testes mais específicos, em arena do tipo múltiplas pareadas. Porém, neste caso, duas placas de petri periféricas receberam o mesmo tipo de grão para disputas grãos vs controle e grãos vs grãos. A hierarquia observada foi: feijão ≥ soja > grão de bico > lentilha. Posteriormente, as fêmeas tiveram que escolher entre: tegumento, tecidos de reserva e meristemático, grão inteiro, grão inteiro umidificado e um controle sem sementes, para os 4 grãos analisados, com o intuito de identificar a parte do grão onde estão os compostos disponíveis para reconhecimento pelas fêmeas. Nenhuma diferença significativa foi observada. Para identificar os compostos voláteis presentes no feijão e no grão de bico, foram realizados ensaios de aeração dos grãos, seguidos por análises de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Foram identificadas 10 substâncias no feijão e 17 no grão de bico. Etenilbenzeno (estireno) se destacou como um composto muito abundante no feijão. A participação desses compostos na escolha do grão ainda precisa ser investigada. Na análise para avaliar a participação das antenas sobre a escolha dos grãos, fêmeas e machos foram divididos em quatro grupos distintos: (1) carunchos sem a antena direita, (2) carunchos sem a antena esquerda, (3) carunchos sem as duas antenas e (4) controle (carunchos com ambas as antenas) e colocados em arena do tipo múltiplas pareadas. A presença de pelo menos 1 antena, tanto em fêmeas quanto em machos, foi determinante para que os carunchos fossem direcionados para a placa que continha algum tipo de grão. O mesmo não foi observado em Z. subfasciatus sem as duas antenas que não foram capazes de identificar onde os grãos estavam. No entanto, apenas as fêmeas apresentaram uma preferência pelo feijão com relação ao grão de bico. Já os machos, demonstraram maior sensibilidade à presença dos grãos ao utilizarem a antena direita quando comparado à antena esquerda. Análises das antenas de fêmeas e machos, por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), mostram elementos sensoriais potencialmente envolvidos na captura da informação olfatória, e existência de dimorfismo sexual. As fêmeas possuem grande quantidade de sensilas basicônicas, conhecidas por responderem a voláteis de plantas. Os machos possuem mais sensilas tricóideas, com função mecano e quimiorreceptora, que normalmente respondem a feromônios. Em conjunto, estes resultados demonstram uma preferência das fêmeas pelo feijão; que os compostos voláteis estão presentes em toda a semente; que a composição química apresentada pelos grãos tem o estireno em destaque nas sementes de feijão e o hexanal juntamente com o octanal em destaque nas semente de grão de bico; que as antenas são fundamentais para o reconhecimento destes compostos pelos insetos, mas apenas as fêmeas demonstram preferência entre os diferentes grãos; e que as antenas apresentam diferentes elementos sensoriais em machos e fêmeas da espécie, podendo ocorrer lateralização fisiológica nas antenas dos machos. Experimentos em andamento deverão revelar os alcances da participação dos compostos identificados nas sementes como infoquímicos envolvidos na seleção de hospedeiros para oviposição e desenvolvimento em Z. subfasciatus.