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Navegando Tese por Orientador(a) "Dias, Amanda Latercia Tranches"

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Análises metabolômicas e influências de antifúngicos e da interação patógeno-hospedeiro na expressão gênica de adesinas e proteases em Candida albicans
    (Universidade Federal de Alfenas, 2020-03-18) Oliver, Josidel Conceição; Dias, Amanda Latercia Tranches; Melhem, Marcia De Souza Carvalho; Padovan , Ana Carolina Barbosa; Dias, Marcos Vinicios Salles; Colombo, Fabio Antonio
    As infecções fúngicas são um problema de saúde pública, especialmente em ambientes hospitalares, nos quais Candida spp. são as principais causadoras de infecções fúngicas invasivas. Dentre os fatores associados à virulência desse gênero destacam-se a produção de adesinas e aspartato proteases, que contribuem para a adesão e invasão dos tecidos do hospedeiro. Acredita-se que a exposição de Candida spp. a fagócitos e/ou a concentrações subinibitórias de antifúngicos pode alterar a expressão dessas proteínas e aumentar a virulência do fungo. Esse trabalho objetivou avaliar fatores associados a virulência tais como metabolômica e expressão dos genes SAP2, SAP4, SAP9, SAP10, HWP1 e ALS3, em isolados clínicos de C. albicans em interação com macrófagos e após exposição a concentrações inibitórias e subinibitórias (1/4 ou 1/8) de antifúngicos. Oito linhagens de C. albicans foram testadas quanto à sensibilidade aos antifúngicos anfotericina B, caspofungina e fluconazol e mostraram-se sensíveis, com exceção da 221-V que foi considerada resistente a caspofungina. A identificação dos isolados foi confirmada por MALDI-TOF, e o perfil metabolômico das linhagens foi analisado por RMN 1H. 66 moléculas foram encontradas no metaboloma, as quais estão envolvidas principalmente no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), na glicólise e gliconeogênese, no metabolismo dos aminoácidos, lipídeos e ácidos nucleicos. Ademais, foram encontradas algumas moléculas associadas a virulência fúngica. A linhagem 221-V destacou-se por apresentar altas concentrações de trealose, glicose, fumarato, arabitol e glicerol, essas moléculas estão associadas a resposta ao estresse oxidativo e osmótico. A partir dos resultados de metabolômica e sensibilidade foram selecionadas três linhagens para ensaios de fagocitose e expressão gênica. Após ensaios de interação Candida-macrófagos, foi observado que os macrófagos eliminaram 34,18±5,43%; 35,30±7,12% e 34,81±4,73% das células de leveduras, nas linhagens 121, 221-V e SC5314. Em relação a expressão gênica analisada por qPCR, a interação Candida-macrófago regulou positivamente a expressão dos genes SAP2 (13,85±1,95), ALS3 (5,81±0,91) e HWP1 (15,66±3,29) em comparação com o controle. Em geral, o tratamento com concentrações subinibitórias de anfotericina B, fluconazol e caspofungina aumentou os níveis de expressão dos genes analisados. A linhagem 221-V destacou-se por aumentar os níveis de expressão dos seis genes avaliados após exposição a caspofungina SAP2 (75,85±10,69), SAP4 (32,19±15,93), SAP9 (6,91±0,85), SAP10 (55,38±25,19), ALS3 (11,81±4,60) e HWP1 (41,38±8,69) em comparação com o controle. Esses resultados mostram que a interação com células hospedeiras e, principalmente, a exposição a concentrações subinibitórias de antifúngicos podem correlacionar-se com o aumento da virulência de C. albicans. Concentrações subinibitórias podem ser utilizadas como tratamento sistêmico empírico ou profilático para pacientes com fatores de risco para candidíase invasiva, bem como, pode incorrer em falha terapêutica devido a parâmetros farmacocinéticos e/ou farmacodinâmicos, a não adesão ao tratamento e erros de dosagem ou ao tempo entre as doses. Além disso, compreender a patogênese fúngica pode auxiliar na pesquisa e desenvolvimento de novas possibilidades terapêuticas, tais como novos fármacos para candidíase, contribuindo assim para a redução da incidência de morbidade e mortalidade associada a infecções fúngicas.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Expressão gênica de Candida albicans frente a diferentes concentrações de antifúngicos e antiretrovirais
    (Universidade Federal de Alfenas, 2017-08-25) Silva, Naiara Chaves; Dias, Amanda Latercia Tranches; Melhem, Márcia De Souza Carvalho; Loyola, Ana Beatriz Alkimim Teixeira; Ariosa, Marília Caixeta Franco
    Importantes atributos associados à virulência podem ser observados em Candida spp., tais como a expressão de genes SAP, os quais são responsáveis por regular a secreção de aspartato proteases (Sapp). Sabe-se que a exposição de Candida spp. a certas substâncias pode alterar o padrão de secreção de enzimas hidrolíticas tais como as Sapp. Essas proteases apresentam estrutura química e sítio ativo semelhante às proteases do vírus HIV, o que sugere que inibidores de proteases usados no tratamento da AIDS possam interagir com as proteases de Candida spp. e influenciar a síntese das proteases. O isolado padrão de C. albicans SC5314 e dois isolados de C. albicans provenientes de casos de infecção hospitalar, classificados como sensíveis ao fluconazol e anfotericina B no teste de sensibilidade, foram cultivados por 24 horas, 37°C, 180 rpm em caldo “Yeast Carbon Base” (YCB) suplementado com soroalbumina bovina (BSA) em diferentes condições de exposição, como a presença de fluconazol e anfotericina B em concentrações inibitórias e subinibitórias e saquinavir e pepstatina A em concentrações efetivas e subefetivas. Avaliou-se a expressão relativa dos genes SAP2, SAP4, SAP7 e SAP9 nos isolados submetidos a esses cultivos usando ACT1 como gene normalizador e os resultados foram analisados pelo método do CT comparativo (2-ΔΔCT) usando a amostra não tratada como controle. A expressão de SAP nos isolados de C. albicans foi maior na presença de concentrações inibitórias/efetivas dos antifúngicos e inibidores de proteases, sendo que, em número absolutos, a expressão desses genes foi ainda maior para os inibidores de proteases. C. albicans SC5314 foi o isolado de maior expressão de SAP e SAP7 foi o gene mais expresso nos isolados, em números absolutos. A fim de investigar a influência das substâncias ativas fez-se avaliação dos cultivos por citometria de fluxo e quantificação de ergosterol. A avaliação por citometria de fluxo não demonstrou grandes alterações de complexidade celular ou desvio de fluorescência indicativo de maior atividade de morte e a quantificação do ergosterol foi significativamente reduzida em relação ao controle apenas na presença de concentração inibitória de fluconazol. Tais resultados sugerem que não deva existir relação direta entre a influência dos antifúngicos e inibidores de proteases sobre a expressão de SAP e os padrões celulares avaliados, entretanto, uma vez que os fatores associados à virulência são correlacionados, tais situações podem influenciar positivamente a expressão dos genes no sentido de promover reposição das proteases a fim de garantir sua patogenicidade.