Mestrado em Engenharia Química

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Navegando Mestrado em Engenharia Química por Assunto "Análise enzimática."

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Imobilização da biomassa catalítica de Aspergillus oryzae IPT-301, caracterização e aplicação na produção de frutooligossacarídeos
    (Universidade Federal de Alfenas, 2018-05-28) Garcia, Rogério Lopes; Perna, Rafael Firmani; Maiorano, Alfredo Eduardo; Hirata, Daniela Battaglia
    Os frutooligossacarídeos (FOS) são açúcares de baixa caloria que apresentam diversos benefícios à saúde humana. São disponibilizados comercialmente mediante produção sintética, por reação de transfrutosilação, utilizando enzimas microbianas como a frutosiltransferase (FTase, E.C.2.4.1.9). Dentre os micro-organismos produtores desta enzima, o Aspergillus oryzae IPT-301 se destaca como fonte potencialmente produtora, sintetizando FTase micelial (aderida a biomassa celular) com atividades hidrolítica (AH) e de transfrutosilação (AT). A razão entre as atividades (AT/AH) é um importante parâmetro que indica a predominância de AT sobre AH. A aplicação deste micro-organismo na produção de FOS pode ser aprimorada por meio da imobilização da biomassa por processo de reticulação visando aumentar a estabilidade da biomassa e possibilitar o seu reuso. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho centrou-se na imobilização da biomassa de Aspergillus oryzae IPT-301 utilizando glutaraldeído como agente de reticulação e caracterização quanto às suas propriedades catalíticas, assim como a determinação dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos e avaliação de sua estabilidade operacional na produção de FOS. A biomassa catalítica foi produzida por fermentação submersa aeróbia, em agitador orbital do tipo Shaker e meio de cultura sintético. Os ensaios de imobilização da biomassa produzida foram realizados por planejamento experimental do tipo DCCR 2² e o efeito de diferentes concentrações de glutaraldeído (GLU) e pH no meio de imobilização foram avaliados. As melhores respostas foram obtidas em pH 7,9 e concentração de GLU 2,1 % (v/v), com AT e AH iguais a 821 ± 28 U.g-1 e 126 ± 10 U.g-1, respectivamente. Quando comparado o ganho de atividade por unidade de massa micelial com o processo de imobilização, foi observado um aumento de 14 % na AT, redução de 40 % na AH e aumento em 86 % da razão (AT/AH). Estas mudanças nas atividades observadas após a imobilização são benéficas por favorecerem maiores rendimentos deste biocatalisador na produção de FOS. Assim, as biomassas livre e imobilizada foram caracterizadas. A biomassa livre apresentou os melhores resultados de atividade entre as temperaturas de 45 ºC e 55 ºC, enquanto as maiores AT e razão (AT/AH) para a biomassa imobilizada foram observadas entre 50 ºC e 55 ºC. Quanto à influência do pH, ambos os biocatalisadores apresentaram maiores AT e razão (AT/AH) em pH 5,5. Desta forma, a temperatura de 50 ºC e o pH 5,5 foram fixados para se realizar a comparação dos biocatalisadores nos ensaios de estabilidade operacional. Os ensaios de estabilidade frente ao pH mostraram que ambos os biocatalisadores foram estáveis na faixa de pH entre 4,5 e 7,5. A análise de estabilidade térmica mostrou por meio dos parâmetros termodinâmicos avaliados que a imobilização da biomassa proporcionou um aumento da termoestabilidade, com a biomassa imobilizada passando a ter um tempo de meia vida a 50 ºC de 5728,5 min, valor este 2,8 vezes maior que o observado para o tempo de meia vida da biomassa livre a 50 ºC. A avaliação da cinética enzimática indicou que os modelos de Hill e de Michaelis-Menten se ajustaram satisfatoriamente ao comportamento da FTase de ambos os biocatalisadores. Foi observada a redução de K0,5, de 97,8 para 85,9 g.L-1 e uma redução de Km, de 121,5 para 98,5 g.L-1 após a imobilização da biomassa catalítica, indicando um aumento da afinidade entre enzima e substrato com a imobilização. A aplicação dos biocatalisadores em ensaios de estabilidade operacional mostrou que a biomassa imobilizada foi estável após 12 ciclos de produção de FOS (atividade relativa de 88,9 ± 2,2 % da atividade inicial), enquanto a atividade da biomassa livre caiu após 12 ciclos de produção para aproximadamente 50 % da atividade inicial, demonstrando assim o ganho de aplicabilidade da biomassa catalítica de Aspergillus oryzae IPT-301 na produção de FOS com o processo de imobilização realizado.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Produção e caracterização da enzima frutosiltransferase de Aspergillus oryzae IPT-301 visando a obtenção de frutooligossacarídeos
    (Universidade Federal de Alfenas, 2017-05-12) Cunha, Josivan De Sousa; Perna, Rafael Firmani; Miranda, Everson Alves; Hirata, Daniela Battaglia; Tardioli, Paulo Waldir
    Os frutooligossacarídeos (FOS) são oligômeros de frutose, cujas unidades frutosil estão ligadas na posição β-(2→1) na molécula de sacarose. Esses açúcares, de baixa caloria, são classificados com prebióticos, não são cariogênicos, podem ser usados por diabéticos, são de 0,4 a 0,6 vezes menos doce que a sacarose, sendo amplamente utilizados pelas indústrias farmacêutica e de alimentos como açúcares funcionais. Apesar dos FOS serem produzidos naturalmente por enzimas presentes em diversos vegetais, são disponibilizados comercialmente por meio da produção sintética, utilizando enzimas de origem microbiana como as frutosiltransferases (FTases, E.C.2.4.1.9) e sacarose como principal substrato. Diante deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a produção de FTases extracelular e micelial de Aspergillus oryzae IPT-301 por fermentação submersa aeróbia utilizando meio de cultura sintético, assim como a caracterização e estudos cinéticos das enzimas produzidas. Também foram investigados os efeitos da temperatura e pH do meio reacional nas atividades enzimáticas mediante técnica de planejamento experimental. Para a produção de FTases foi necessário o cultivo do micro-organismo em meio de cultura estéril e a fermentação foi conduzida em agitador orbital do tipo shaker. Com o caldo de fermentação filtrado e o micélio úmido foi possível determinar as atividades de transfrutosilação (quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de FOS por minuto nas condições experimentais) e hidrolítica (quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de frutose por minuto nas condições experimentais) extracelular e micelial, respectivamente, para as diferentes condições experimentais avaliadas. A concentração máxima de biomassa celular obtida foi de 9,35 ± 1,26 g.L-1 em 48 h de fermentação, sendo que em 76 h, houve a produção de 7,51 ± 1,57 g.L-1, período em que ocorreu a acidificação do caldo fermentado (pH 4,82). As condições nas quais a enzima extracelular obteve maior atividade de transfrutosilação foi aquela produzida em 64 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional de 50 °C, concentração de sacarose a partir de 296,0 g.L-1, apresentando estabilidade entre 30 e 35 ºC e em pH 6,0. Por outro lado, a FTase micelial mostrou sua máxima atividade quando produzida em 72 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional entre 45-55 °C, concentração de substrato igual a 470,6 g.L-1, indicando estabilidade para faixas de pH entre 6,0-8,0 e temperatura entre 30-40 ºC. A FTase extracelular apresentou cinética michaeliana em relação à concentração de substrato, exibindo valores de Vmax igual a 16,23 U.mL-1 e Km de 50,41 g.L-1 , enquanto a FTase micelial ajustou-se satisfatoriamente ao Modelo de Hill, cujos valores dos parâmetros Vmax, K0,5 e n foram iguais a 342,23 U.g-1 e 234,73 g.L-1 e 1,41, respectivamente. O estudo da influência do tempo e da temperatura reacional na síntese de FOS mostrou que a FTase extracelular produziu maior concentração de FOS a 50 °C, enquanto a FTase micelial a 40°C. A otimização do processo para a obtenção de FOS comprovou que a zona ótima da FTase extracelular (em que elevada atividade de transfrutosilação e baixa atividade hidrolítica são esperadas) ocorreu nas faixas de temperatura entre 45-50 °C e de pH entre 5,5-6,75. Para a FTase micelial, apenas a atividade de transfrutosilação ajustou-se satisfatoriamente ao modelo quadrático com interação, cuja zona ótima ocorreu em temperaturas superiores a 46 °C e valores de pH abaixo de 6,5. Os resultados obtidos atestaram que o fungo se destacou como fonte produtora de FTases e, estas, por sua vez, mostraram-se promissoras para a obtenção de FOS em escala laboratorial.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Separação da enzima frutosiltransferase produzida por Aspergillus oryzae IPT-301 em uma coluna de bolhas e espuma
    (Universidade Federal de Alfenas, 2018-05-14) Oliveira, Marcela Fernandes De; Basso, Rodrigo Corrêa; Andrade, Grazielle Santos Silva; Sampaio, Klicia Araújo
    Fruto-oligossacarídeos (FOS) são açúcares com importantes propriedades funcionais. Eles são catalisados por reações de hidrólise da inulina ou por meio da reação de transfrutosilação a partir da sacarose. A enzima responsável pela formação de FOS a partir da sacarose é a frutosiltransferase. Industrialmente esta enzima é obtida a partir de micro-organismos, dentre eles alguns tipos de fungos como os do gênero Aureobasidium, Penicillium e Aspergillus. A produção de FOS utilizando-se da enzima, ao invés do processo fermentativo realizado pelo micro-organismo, permite que sejam utilizadas as condições ótimas de catálise deste biocatalisador. Diante da crescente demanda por FOS, o desenvolvimento de tecnologia nacional voltada à separação e recuperação da enzima frutosiltransferase é de grande importância. Deste modo, esse trabalho tem por objetivo a recuperação da enzima frutosiltransferase produzida pelo fungo Aspergillus oryzae IPT-301. Para isso, o processo de separação foi realizado em uma coluna de bolhas e espuma, para a qual foram estudados pH, diluição do meio e concentração do surfactante Tween 80® adicionado. A capacidade de formação de espuma para a realização do processo foi obtida pela adição de concentrações entre 0,5 e 2% (m/v) de Tween 80®. Os resultados de atividade enzimática indicaram que a concentração de 1% (m/v) de Tween 80® adicionado após a fermentação provocaram aumento na atividade de transfrutosilação (At) e redução da atividade hidrolítica (Ah), atingindo valores de 22,47 e 1,60 U.mL-1. Os ensaios na coluna de bolhas e espuma indicaram que utilização de 0,5% e 1,5% (m/v) de surfactante ao caldo fermentado com diluição 1:2 e sem diluição, respectivamente, em pH 5,5 atingiram melhores resultados. O método Dumas, para determinação de proteínas, mostrou-se inadequado para a determinação da concentração de enzimas nos sistemas estudados, muito provavelmente devido a concentração destas ser inferior ao limite de quantificação do equipamento.