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Avaliação de diferentes estratégias de imobilização, caracterização das propriedades catalíticas e determinação dos parâmetros termodinâmicos para a lipase produzida por Geotrichum candidum, visando seu emprego na produção de ácidos graxos concentrados
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-06-09) Ferreira, Matheus Moreira; Hirata, Daniela Battaglia; Mendes, Adriano Aguiar; Tardioli, Paulo Waldir
As lipases (triacilglicerol éster hidrolases E.C. 3.1.1.3) são importantes biocatalisadores devido à sua afinidade por vários substratos e à sua quimio, régio e enantiosseletividade. Elas atuam na hidrólise de triacilgliceróis para produção de ácidos graxos livres e na reação inversa (esterificação) em meios não aquosos. Uma lipase produzida por Geotrichum candidum (G. candidum) possui seletividade para a hidrólise das ligações ésteres de ácidos graxos insaturados de cadeia longa, como os ácidos oleico e linoleico, presentes em diversos triacilgliceróis. Esse tipo de seletividade permite que essas ligações sejam rapidamente hidrolisadas aumentando a velocidade e consequentemente a eficiência do processo de hidrolise de óleos vegetais. Entretanto, o alto custo das enzimas ainda é um fator limitante para sua ampla utilização. A imobilização, em suportes sólidos, pode ser uma alternativa para viabilizar o emprego das enzimas em processos industriais, permitindo seu reuso e ainda melhorarando sua estabilidade e/ou seletividade. Nesse contexto, o presente trabalho avaliou diferentes estratégias de imobilização, bem como a caracterização das propriedades catalíticas e a determinação dos parâmetros termodinâmicos da lipase produzida por G. candidum (LGC) via fermentação submersa, para a produção de ácidos graxos concentrados pela hidrólise de diferentes óleos vegetais (oliva, algodão e palmiste). Ensaios preliminares de imobilização da LGC em suportes hidrofóbicos (octil-agarose e octil-sílica) mostraram que estes não foram capazes de realizar a purificação da enzima do caldo de fermentação tão eficientemente quanto polihidroxibutirato (PHB) via imobilização, devido às diversas impurezas presentes no caldo de fermentação. Assim, a LGC bruta foi purificada via precipitação por solvente orgânico para melhor analisar a imobilização em diferentes tipos de suporte e por distintos métodos de imobilização, como a adsorção física e a iônica e a ligação covalente multipontual. Dentre estes métodos, a máxima atividade hidrolítica (45,4 ± 0,2 U/ g de biocatalisador) e a maior porcentagem de atividade recuperada (22,8 %) foram observadas para a imobilização de LGC por adsorção iônica em MANAE-agarose. Foram avaliadas as propriedades catalíticas da LGC purificada e imobilizada em MANAE-agarose, observando uma maior estabilidade da lipase em uma ampla faixa de pH e maior estabilidade térmica quando comparado com a enzima livre. A imobilização da LGC em MANAE-agarose também reduziu em 50% a energia de ativação (Ea) e aumentou a quantidade de produto formado em reações de hidrólise, verificado através do cálculo dos parâmetros cinéticos como a velocidade de reação máxima (vmáx) e a constante de Michaelis-Menten (Km). A hidrólise do óleo de oliva pela LGC imobilizada em MANAE-agarose sem a adição de emulsificantes atingiu 100% de hidrólise em 120 minutos de reação, sendo superior a enzima livre (95,5% em 140 min). No entanto, na reutilização do biocatalisador observou-se uma redução de 50% na reação de hidrólise para o segundo ciclo e de 5,5% para o terceiro ciclo. Os resultados obtidos na hidrólise dos óleos de algodão e de palmiste mostraram que a LGC livre expressa sua máxima atividade hidrolítica em pH 8,0 e temperatura de 37 °C, para ambos os substratos empregados. Entretanto, uma maior atividade foi observada para o óleo de algodão, devido à quantidade de ácidos graxos insaturados presentes em sua composição (≈ 71%) comparando-se com o óleo de palmiste (≈ 19%).