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Acesso aberto (Open Access)
Análise da localização, da expressão gênica e predição estrutural de adesinas hipotéticas no patógeno emergente Trichosporon asahii
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-02-28) Lima, Alexandre Anderson De; Padovan, Ana Carolina Barbosa; Gouveia, Viviane Alves; Dias, Amanda Latércia Tranches
O gênero Trichosporon spp. pertence ao filo Basidiomycota e atualmente conta com 12 espécies, sendo Trichosporon asahii a que possui maior relevância clínica, causando infecções invasivas que alcançam uma taxa de mortalidade de até 80%, o que depende do estado imunológico do paciente, da capacidade do fungo em crescer em diferentes morfologias e da susceptibilidade limitada aos antifúngicos, bem como, de sua capacidade de formar biofilmes. A formação de biofilmes depende da síntese de adesinas que medeiam as interações célula-meio nas diferentes morfologias do fungo. Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram verificar se proteínas com função preditiva de adesinas são expressas em leveduras e hifas de T. asahii e se são encontradas na superfície celular deste fungo, bem como analisar os modelos tridimensionais dessas adesinas. Para isso, camundongos isogênicos 129/Sv foram inoculados com extrato de proteínas totais de leveduras e de hifas para geração de antissoros policlonais que foram avaliados por ensaio imunoenzimático (ELISA), mostrando que houve diferença na quantidade de anticorpos gerados contra as proteínas totais de leveduras e hifas e que os mesmos reconheceram diferencialmente os extratos proteicos opostos aos quais foram produzidos de forma significativa (p<0,05), e que os anticorpos gerados contra proteínas de hifas possuem maior força de ligação. Os antissoros policlonais foram utilizados em ensaios de microscopia de imunofluorescência, ambos contra leveduras e contra hifas, mostrando reconhecimento das diferentes morfologias de forma semelhante e independente das células terem passado por tratamento de permeabilização ou não. Além disso, quatro proteínas previamente caracterizadas in silico por nosso grupo como potenciais adesinas (Restina-like, CFL1-like, Mar-like e Beta-like) tiveram sua estrutura proteica terciária modelada no servidor I-TASSER. A partir de cinco modelos gerados para cada adesina foi escolhido aquele que apresentou o maior valor de confiança (C-score). Em seguida, as sequências de aminoácidos das proteínas foram analisadas no programa TepiTool no NetMHCII para identificar peptídeos reconhecidos por alelos do MHC classe II humanos e H2 murino. Os peptídeos foram então, analisados no programa VaxiJen v. 2.0 para verificar a imunogenicidade dos mesmos, com ponto de corte > 0,5. Em seguida, os peptídeos de cada proteína foram localizados na estrutura 3D de cada proteína no programa PyMol 3.1. Finalmente, foram selecionados aqueles que se encontraram na superfície de cada modelo proteico e próximos à região N-terminal. Estes peptídeos foram sintetizados por empresa comercial e inoculados em camundongos para produção de antissoro específico contra cada peptídeo. Através dos anticorpos policlonais gerados contra cada peptídeo, proteínas de superfície foram detectadas na superfície de leveduras e de hifas de T. asahii. O ensaio piloto de reconhecimento de proteínas por Western blot não trouxe conclusões definitivas a repeito da eficácia do reconhecimento das adesinas pelos anticorpos gerados contra os peptídeos. A análise de expressão gênica das quatro potenciais adesinas em leveduras e hifas mostrou que todas são sintetizadas em maior grau nas hifas de T. asahii. A partir das estruturas 3D das quatro adesinas foi realizado ensaio in silico de docking molecular, mostrando que todas as quatro adesinas se ligam a proteínas humanas que são alvo da adesão celular de patógenos. Este trabalho contribuiu para a compreensão da interação molecular entre o patógeno emergente T. asahii e os tecidos de seu hospedeiro humano.