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Acesso aberto (Open Access)
Equilíbrio químico e cinética enzimática da interação de alfa-amilase com compostos fenólicos encontrados em cerveja
(Universidade Federal de Alfenas, 2016-12-16) Oliveira, George Augusto Veloso De; Silva, José Maurício Schneedorf Ferreira Da; Mendes, Adriano Aguiar; Carvalho, Sidney Jurado De
A α-amilase é uma enzima chave na produção das cervejas por ser responsável pela clivagem do amido em açúcares fermentáveis. Durante o processo de preparação do mosto que ocorre de 40 a 80°C, essa enzima pode ser afetada por polifenóis presentes na mistura. O objetivo foi avaliar a cinética e o equilíbrio da interação de α-amilase com polifenóis usualmente presentes em cerveja e nas faixas de temperatura empregadas no processo. Para tanto, polifenóis comumente encontrados em cerveja (ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido ferúlico e quercetina) foram incubados com α-amilase em 298, 313 e 323K, a atividade da enzima foi determinada por absorção molecular pelo método de triiodina, e os resultados tratados pela equação integrada de Michaelis-Menten. O equilíbrio químico da interação foi abordado por titulação espectrofluorimétrica em 293, 303, 313, 323 e 333 K. Os resultados apresentaram valores dos parâmetros cinéticos de α-amilase a 323K de Km 1,37 ±0,19 mg.mL-¹ e Vmax 0,66 ±0,08 mg.mL-¹.min-¹, e um modelo de inibição competitiva apresentando Ki entre 2,00x10-5 ±4,50x10-7 mol.L-¹ e 4,52x10-5 ±2,24x10-6 mol.L-¹. Foram encontrados valores de energia de ativação da enzima para ácido clorogênico > ácido ferúlico > ácido cafeico > quercetina. O ácido clorogênico foi o que apresentou maior estabilidade na formação dos complexos, com menor valor de Ki, maior sensibilidade com a temperatura e maior inibição na temperatura ótima da enzima (323K), antagonicamente aos valores apresentados para a quercetina. Os resultados da interação ligante-enzima revelaram valores de Kb crescente com a temperatura, sugerindo maior estabilidade na formação do complexo próximo a 323 K, e coincidentes com os resultados de inibição enzimática. Os valores para ∆H e ∆S sugerem um mecanismo entropicamente dirigido da associação. Estudo da relação estrutura-atividade demonstrou uma correlação positiva entre a atividade biológica (ligação e catálise) da α-amilase com os descritores de natureza polar dos polifenóis (número total de doadores e aceptores de ligações de hidrogênio, polarizabilidade, TPSA, Pka). Ensaios de interação da enzima com ácido clorogênico em diferentes valores de pH e força iônica apoiam os dados de estrutura-atividade, e sugerem a participação do íon carboxilato do ligante na interação com grupos básicos na vizinhança do sítio catalítico da enzima.
Acesso aberto (Open Access)
Purificação de ricina, caracterização amperométrica de atividade, e novos candidatos a inibidores
(Universidade Federal de Alfenas, 2020-12-10) Oliveira, George Augusto Veloso De; Silva, José Maurício Schneedorf Ferreira Da; Pissetti, Fábio Luiz; Rodrigues, Marina Quadrio Raposo Branco; Ferreira, Elivelton Alves; Santos, André Luiz Dos
A mamoneira (Ricinus communis L.) é uma oleaginosa de alto valor econômico com mercado global de óleo de mamona crescente a uma taxa anual de cerca de 4,3%, com expectativa de um mercado global avaliado em US$ 1470 milhões para 2025. A presença da ricina, uma fitotoxina heterodimérica encontrada no endosperma das sementes de mamona, exige cautela no uso, devido a extrema toxicidade desta fração proteica. Em paralelo aos riscos da manipulação da mamona na industria de biocombustível e polímeros, a ricina é classificada por autoridades internacionais como potencial agente para uso no bioterrorismo, uma vez que não há antídoto farmacológico de sua ação letal aprovado por agências governamentais. Neste trabalho, relatou-se um novo ensaio para a detecção de ricina e sua atividade enzimática centrada na depurinação do DNA de esperma de arenque (hsDNA, herring sperm DNA), por eletro-oxidação do analito em superfície eletródica não modificada. Em paralelo, buscou-se também avaliar parâmetros de interação e potencial inibitório de novos candidatos para inibição da toxina, respectivamente por espectrofluorimetria e pelo procedimento eletroquímico definido. Os ensaios baseados em voltametria de onda quadrada sugerem que a liberação de adenina catalisada por ricina exibiu um comportamento bifásico, com um estado pré-estacionário precedendo o comportamento de Michaelis-Menten, e com constantes cinéticas de 75 µmol.L-1 para Km e valor Kcat de 19 µmol.L-1 .min-1 . Os estudos demonstraram que o novo método para a detecção de ricina é relativamente simples, emprega eletrodos de pasta de carbono não modificada, e pode ser adaptado a várias fontes de amostras suspeitas e dispositivo de detecção. Os ligantes selecionados como alvos possíveis para ricina apresentaram valores significativos para as constantes de formação dos complexos Kb (22,6 ± 3,3 a 111,3 ± 7,4 x104L.mol-1 ). Os parâmetros termodinâmicos obtidos com variação de pH e de temperatura sugerem que a formação dos complexos foi entropicamente dirigida, com mecanismo de interação relacionado predominantemente ao efeito hidrofóbico. As moléculas apresentaram valores de inibição melhores comparados aos inibidores obtidos comercialmente e podem representar uma alternativa promissora na inibição da atividade catalítica da ricina.