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Acesso aberto (Open Access)
Bioprospecção da espécie Miconia willdenowii visando a obtenção de substâncias com potencial antichagásico
(Universidade Federal de Alfenas, 2015-07-31) Rosa, Welton; Soares, Marisi Gomes; Ambrozin, Alessandra Regina Pepe; Sartorelli, Patrícia
Neste trabalho, foram preparados inicialmente dez diferentes extratos brutos etanólicos de diferentes espécies vegetais da região da mata atlântica mineira das proximidades do município de Alfenas-MG. Após a padronização do teste antichagásico in vitro contra as formas epimastigotas da cepa Y, e utilizando-se o método colorimétrico com solução de resazurina, todos os extratos foram submetidos ao bioensaio, o que permitiu a determinação do extrato de maior potencial anti-epimastigota como sendo da Miconia willdenowii, da família Melastomataceae. Tal extrato, foi posteriormente submetido a particionamento por extração líquido-líquido com hexano, acetato de etila e uma mistura etanol:água (1:3), o que permitiu separar compostos em grupos por diferença de polaridade. As 3 frações obtidas foram novamente submetidas ao teste biológico, para determinação do grupo de compostos de maior atividade. A fração acetato foi assim determinada como a de maior potencial contra as formas epimastigotas dos parasitas da doença de Chagas, sendo esta submetida ao fracionamento por cromatografia em coluna, obtendo-se assim ao final, um total de 12 subfrações. Estas foram na sequência submetidas também ao teste in vitro, determinando-se as de maior potencial contra os epimastigotas. No geral, três destas subfrações apresentaram maior atividade antichagásica (A2, A3 e A4), as quais foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) por conseguinte, a partir das quais puderam ser isoladas dois derivados de hidroquinonas, já relatadas para outras espécies de Miconia: miconidina e primina. As duas substâncias tiveram suas estruturas identificadas por espectroscopia de RMN e também espectrometria de massas, e confirmadas com dados da literatura. A quantificação das duas substâncias isoladas foi feita para cada amostra de M. willdenowii (extrato bruto, fração acetato e subfrações), o que permitiu deduzir que a presença de tais compostos, nestas amostras, é a principal responsável pela atividade tripanocida apresentada pelas mesmas. O bioensaio anti-T. cruzi realizado também para os compostos isolados permitiu observar o alto potencial tripanocida frente a forma epimastigota do parasita, apresentando valores de CE50 inferiores até mesmo que a droga padrão de referência, o benznidazol. O teste de citotoxicidade in vitro com fibroblastos derivados de pele humana normal também com a miconidina e primina, isoladas de M. willdenowii, demonstrou que estas só apresentavam efeito adverso a partir de 50 µg/mL (dentre as concentrações testadas), valor este superior ao CE50 apresentado pelas mesmas, sugerindo o alto potencial efetivo de utilização destes compostos na terapia da doença de Chagas.
Acesso aberto (Open Access)
Bioprospecção em espécies vegetais da família Fabaceae, da mata atlântica mineira, visando a obtenção de substâncias com potencial anti- inflamatório
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-03-12) Rosa, Welton; Soares, Marisi Gomes; Fernandes, João Batista; Cass, Quezia Bezzera; Zanin, João Luiz Baldini; Ambrozin, Alessandra Regina Pepe
Extratos brutos das folhas de 47 espécies diferentes de Fabaceae foram explorados quanto à atividade anti-inflamatória em diferentes mecanismos de ação na busca por compostos com potencial anti-inflamatório. Inicialmente, os extratos foram testados quanto à atividade antioxidante in vitro onde nove espécies apresentaram grande potencial, comparável ao ácido ascórbico. Em seguida, um bioensaio ex vivo com sangue humano foi desenvolvido quanto à produção de IL-10, sob condições inflamatórias. Assim, foi possível avaliar o potencial das amostras de extrato das espécies de Fabaceae em inibir a produção desta citocina e 22 destas apresentaram potencial de inibição comparável à dexametasona, com CE50 médias inferiores a 50 μg/mL. Utilizando-se a mesma metodologia ex vivo no sangue humano, outro ensaio foi desenvolvido para avaliação da atividade anti-inflamatória por meio do monitoramento da produção de PGE2 por detecção em LC-MS/MS. O método validado apresentou-se eficaz para triagem da atividade anti-inflamatória de grande número de amostras, no qual cinco do total de espécies estudadas neste trabalho apresentaram potencial de inibição da produção de PGE2. Dentre as 47 amostras testadas, a espécie P. Pluviosa apresentou-se ativa nestes três diferentes mecanismos de ação testados contra a inflamação, corroborando o grande potencial anti- inflamatório desta espécie com relatos da literatura. Dentre as cinco espécies ativas no ensaio ex vivo no sangue quanto à inibição da produção de PGE2, quatro delas apresentaram também potencial anti-inflamatório na inibição de edema de orelha in vivo, confirmando a eficácia do ensaio ex vivo desenvolvido no sangue para triagem da atividade anti-inflamatória. Além disso, dentre estas quatro espécies, duas delas (A. polyphylla e P. pluviosa) apresentaram ainda potencial de inibição de recrutamento de neutrófilos, avaliadas pelo ensaio de MPO nos fragmentos de orelha, demonstrando o grande potencial anti-inflamatório destas espécies, sendo A. polyphylla inédita quanto a esta propriedade farmacológica até o momento. O estudo da composição das amostras ativas contra inflamação foi feito por duas abordagens: a primeira delas consistiu da anotação de picos de forma bioguiada, utilizando-se a ferramenta moderna de fragmentação in silico MetFrag, dos compostos majoritários presentes nos extratos das amostras inibidoras da produção de PGE2 no sangue e comparação qualitativa destes compostos nestes extratos, a fim de se buscar identificar putativamente os compostos ali presentes e possivelmente responsáveis pela inibição da produção de PGE2 no sangue. A outra abordagem utilizou estudos metabolômicos na qual os biomarcadores simultâneos nos diferentes mecanismos de ação (neste caso a atividade antioxidante e inibição da produção de IL-10 e PGE2) foram determinados e posteriormente anotados, também com o auxílio do MetFrag, como forma de identificação putativa mais abrangente e objetiva dos compostos mais importantes contra a inflamação entre as amostras de Fabaceae testadas. Dentre os compostos anotados nas duas diferentes abordagens, destacam-se flavonoides glicosilados ou agliconas, triterpenos, saponinas, esfingolipídios, alcaloides, elagitaninas e derivados de ácido elágico, e ainda outros menos comuns como flavonoides clorado, sulfurado ou nitrogenado. Estes resultados permitirão guiar o isolamento para confirmação da estrutura e atividade anti- inflamatória destes compostos, em trabalhos futuros. Por fim, um método para comparação dos níveis de PGE2 e LTB4 nos fragmentos de orelha advindos do ensaio in vivo foi desenvolvido, permitindo comparar os grupos de amostras dos controles negativo e positivos (indometacina e dexametasona), bem como da espécie P. pluviosa. O método apresentou-se eficaz como ensaio limite para diferenciação dos níveis de PGE2 e LTB4 entre os grupos de amostras testados no ensaio de edema de orelha, permitindo inferir que P. pluviosa possa agir inibindo possivelmente nas vias COX e LOX simultaneamente, ou ainda da PLA2, como os anti-inflamatórios esteroidais, corroborando com trabalhos na literatura sobre esta espécie. Por fim, este trabalho possibilitou o desenvolvimento de diferentes metodologias para avaliação da atividade anti-inflamatória ex vivo, como métodos de triagem prévios à avaliação em ensaios in vivo e, os métodos de quantificação de PGE2 no sangue ou PGE2 e LTB4 nos fragmentos de orelha poderão ser utilizados em trabalhos futuros, seja em estudos com amostras de produtos naturais ou sintéticas, para avaliação da possível inibição das vias COX e LOX contra a inflamação.