Doutorado em Ciências Fisiológicas

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Navegando Doutorado em Ciências Fisiológicas por Orientador(a) "Souza, Giovane Galdino De"

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Avaliação da participação dos receptores potencial transiente vanilóide do tipo 1 e Toll like 4 e células gliais talâmicas durante a dor neuropática em camundongos
    (Universidade Federal de Alfenas, 2023-07-04) Elisei, Lívia Maria Silvestre; Souza, Giovane Galdino De; Souza, Guilherme Rabelo De; Moura, Clarice De Carvalho Veloso; Marinho, Bruno Guimarães; Veras, Flavio De Protasio
    As células gliais estão envolvidas em diversas dores crônicas, incluindo a dor neuropática (DN). Elas potencializam as descargas neuronais oriundas da lesão periférica no tálamo, por meio do aumento na expressão de receptores que ativam cascatas de sinalização intracelulares, com consequente síntese e liberação de citocinas pró-inflamatórias. Sendo assim, o presente estudo investigou a participação das células gliais frente a ativação dos receptores TLR4 (receptor Toll like 4) e TRPV1 (receptor transiente do potencial vanilóide 1) e da via MAPK p38 (mapquinase p38)/NFκB (fator nuclear kappa B) no tálamo ventrobasal de camundongos com DN. Para tal, foram utilizados camundongos C57BL6 machos e a injúria por constrição crônica (CCI) foi utilizada para induzir alodinia mecânica. A avaliação da coordenação motora de animais neuropáticos após tratamento com inibidores farmacológicos foi realizada no 14º dia de neuropatia por meio do teste rota rod. Examinamos a participação das células da glia, dos receptores TLR4 e TRPV1, MAPK p38 e do NFκB na manutenção da alodinia mecânica no tálamo de animais com 14 dias de neuropatia. O tálamo foi extraído a fim de analisar a expressão e síntese proteica de marcadores gliais, Iba1 (molécula adaptadora ionizada de ligação ao cálcio 1), TMEM119 (proteína transmembrana 119) e GFAP (proteína glial fibrilar ácida), dos receptores TLR4 e TRPV1 e da via MAPK p38 utilizando a técnica de Western Blot e RT-PCR, bem como, os níveis de citocinas TNFα e IL1β por meio do ELISA. A ativação do TLR4 em células da glia em animais neuropáticos também foi examinada no tálamo por meio da imunofluorescência. Como resultado, as microinjeções administradas no tálamo ventrobasal contralateral à lesão por CCI, reduziram significativamente a alodinia mecânica sem alterações motoras. A expressão e síntese proteica aumentada para Iba1/TMEM119, GFAP e TLR4 foram demonstradas no tálamo ventrobasal, após 14 dias de CCI, com aumento dos níveis de TNFα, corroborando com a co-localização entre marcadores gliais e o TLR4. Sendo assim, sugerimos que as células da glia tem determinante participação na neuromodulação da dor neuropática à nível talâmico por meio da ativação do receptor TLR4, permitindo o NFκB a transcrição gênica para a produção de TNFα a qual contribui para o estado persistente de dor
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Avaliação da participação espinal dos sistemas endocanabinoide e opioide na antinocicepção induzida pela terapia por ondas de choque em camundongos com dor pós-operatória.
    (Universidade Federal de Alfenas, 2023-05-03) Malta, Iago Henrique Silva; Souza, Giovane Galdino De; Parizo, Nivaldo Antônio; Nunes, Pedro Henrique Gobira; Moreira, Fabrcio De Araujo; Garcia, Tayllon Dos Anjos
    A dor pós-operatória (DPO) ocorre após procedimentos cirúrgicos e, apesar de ser um evento esperado, afeta a qualidade de vida e funcionalidade do indivíduo. Se não for corretamente controlada, essa dor pode se tornar crônica, causando um problema persistente. O tratamento de escolha para esse tipo de dor é a terapia farmacológica e, apesar de sua eficácia, essa modalidade apresenta efeitos adversos indesejados. Assim, as terapias não farmacológicas, como a terapia por ondas de choque (TOC), atenuam a dor de origem musculoesquelética com menos efeitos adversos. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos antinociceptivos da TOC, principalmente no sistema nervoso central. Portanto, o objetivo foi investigar, a nível espinal, a participação do sistema endocanabinoide (SEC) e do sistema opioide (SOP) no efeito antinociceptivo da TOC em camundongos com DPO. Para isso, camundongos C57BL/6 machos foram submetidos à cirurgia de incisão e retração de pele e músculo (IRPM) na coxa direita para indução de DPO. O limiar nociceptivo mecânico desses animais foi avaliado pelos monofilamentos de von Frey. A cirurgia de IRPM induziu DPO do 1º ao 28º dia pós-operatório. Os animais receberam então duas aplicações, no 14º e no 16º dia pós-operatório, com 100, 200 ou 400 pulsos da TOC, com densidade de fluxo de energia de 0,11 mJ/mm 2 , 10 Hz e área de aplicação de 5 mm na região medial da coxa direita, ou tratamento sham. No 16º dia, após a segunda aplicação da TOC, o limiar nociceptivo foi avaliado novamente. As doses de 100 e 200 reduziram a DPO por 60 minutos. A participação dos receptores CB 1 e CB 2 foi avaliada pela pré-administração no 16º dia (antes da segunda aplicação de TOC) dos antagonistas seletivos de CB 1 AM251 (0,1,1 e 10 µg), CB 2 AM630 (3,6 e 12 µg), e houve uma redução dose-dependente da antinocicepção da TOC. Por outro lado, a pré-administração do inibidor da recaptação de anandamida (AEA) VDM11 (1,2 e 4 µg) e o inibidor da enzima monoacilglicerol lipase (MAGL) JZL184 (0,5, 1 e 2 μg) potencializaram e prolongaram a antinocicepção da TOC. Similarmente, a pré-administração de Naloxona (1,2 e 4 μg), antagonista não seletivo dos receptores opioides, Cloccinamox (1,2 e 4 μg), antagonista seletivo dos receptores opioides μ e Nor- binaltorfimina (1,25,2,5 e 5 μg), antagonista seletivo dos receptores opioides κ, mostrou que a antagonização dos receptores opioides, não seletivamente e seletivamente, diminuiu de forma dose-dependente a antinocicepção da TOC. A avaliação no 16º dia dos níveis espinais de AEA e 2-araquidonoilglicerol (2-AG) por cromatografia líquida/espectrometria de massa revelou um aumento nos níveis somente de 2-AG nos animais tratados. A análise de Western Blot mostrou uma diminuição na expressão espinal de MAGL, porém não houve alteração na expressão entre os grupos da expressão de CB 1 , CB 2 e da enzima hidrolase de amidas de ácidos graxos (FAAH). Adicionalmente, a avaliação espinal da expressão dos receptores μ, κ e δ opioides não apresentou diferença estatística entre os grupos. Finalmente, a avaliação espinal dos níveis das citocinas IL-1β, TNF-ɑ e IL- 10 pela técnica de ELISA evidenciou uma redução dos níveis de IL-1β nos animais com DPO tratados com TOC em comparação com os animais não tratados, mas nenhuma diferença entre os grupos foi identificada para as outras citocinas. Com base nos achados do presente estudo, é possível sugerir que a TOC atenua a DPO e que tanto o SEC como o SOP possam participar do efeito antinociceptivo dessa terapia.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Investigação da participação do HMGB1 na ativação dos receptores RAGE e TLR4 em células da glia espinais durante a dor neuropática induzida por Paclitaxel
    (Universidade Federal de Alfenas, 2022-09-08) Moraes, Thamyris Reis; Souza, Giovane Galdino De; Silva, Morgana Duarte; Duarte, Igor Dimitri Gama; Marinho, Bruno Guimarães; Garcia , Tayllon Dos Anjos
    A dor neuropática induzida por quimioterapia é o principal efeito adverso de fármacos quimioterápicos e está relacionada à diminuição da qualidade de vida dos pacientes acometidos por câncer, podendo levar até à descontinuação do tratamento. A nível espinal, a modulação desse tipo de dor envolve não só neurônios, como também as células da glia que quando ativadas aumentam a expressão de receptores e sinalizações intracelulares resultando na liberação de mediadores pró-inflamatórios. A proteína de alta mobilidade do grupo box-1 (HMGB1) é liberada durante a dor neuropática e seu papel no desenvolvimento da dor consiste em sua interação com receptores ativando vias de sinalização. Deste modo, o presente estudo investigou o papel do HMGB1 em células da glia, nos receptores RAGE e TLR4 e na sinalização de MAPK p38 e NFkB, bem como o envolvimento destas vias na dor neuropática induzida por paclitaxel. Para tal, foram utilizados camundongos machos C57BL/6 e C57BL/6 TLR4 (-/-) pesando entre 20 e 25g. Foi utilizado o aparato von Frey filamentos para avaliação do limiar nociceptivo. Para a indução da dor neuropática foi utilizado o agente quimioterápico paclitaxel, o qual foi administrado em dias alternados por 6 dias. A proteína recombinante HMGB1 foi administrada i.t. para investigar o efeito da mesma sobre o limiar nociceptivo. A participação dos receptores RAGE e TLR4 foi investigada por meio dos respectivos antagonistas FPS-ZM1 e LPS-RS administrados via intratecal (i.t). A participação de micróglia, astrócitos, da MAPK p38 e do NFkB foi avaliada utilizando os inibidores minociclina, fluorocitrato, SML0540 e PDTC, respectivamente, também por via i.t. Foi feito o ensaio de Western blot para avaliar os níveis proteicos de HMGB1, RAGE, TLR4, Iba1 e GFAP e o ensaio de Elisa para avaliação dos níveis de HMGB1, TNF-α e IL1-β. Os resultados indicam a participação dos receptores RAGE e TLR4, da micróglia, astrócitos e da sinalização MAPK p38 e NFkB tanto na nocicepção induzida por HMGB1 como na dor neuropática induzida por paclitaxel. Também foi observado o aumento dos níveis proteicos de HMGB1 na gênese da dor neuropática, e o envolvimento dos receptores TLR4 na ativação microglial. O bloqueio dos receptores RAGE e TLR4 levou à diminuição das citocinas pró-inflamatórias. Os resultados indicam que o HMGB1 liberado na fase inicial da do tratamento com paclitaxel ativa receptores RAGE e TLR4 na micróglia, aumentando níveis de citocinas pró- inflamatórias e contribuindo para a dor neuropática.
    Chemotherapy-induced neuropathic pain is the main adverse effect of chemotherapeutic drugs and is related to a decrease in the quality of life of cancer patients, which can even lead to treatment discontinuation. At the spinal level, the modulation of this type of pain involves not only neurons but also glial cells that, when activated, increase the expression of receptors and intracellular signaling, resulting in the release of pro-inflammatory mediators. The high- mobility box-1 protein (HMGB1) is released during neuropathic pain and its role in pain development consists of its interaction with receptors activating signaling pathways. Therefore, the present study investigated the role of HMGB1 in glial cells, RAGE, and TLR4 receptors, and MAPK p38 and NFkB signaling, as well as the involvement of these pathways in paclitaxel-induced neuropathic pain. For this, C57BL/6 and C57BL/6 TLR4 (-/-) male mice weighing between 20 and 25g were used. The von Frey filaments apparatus was used to assess the nociceptive threshold. For the induction of neuropathic pain, the chemotherapy agent paclitaxel was used, which was administered every other day for 6 days. Recombinant HMGB1 protein was administered i.t. to investigate its effect on the nociceptive threshold. The participation of RAGE and TLR4 receptors was investigated using the respective antagonists FPS-ZM1 and LPS-RS administered intrathecally. The participation of microglia, astrocytes, MAPK p38 and NFkB was evaluated using the inhibitors minocycline, fluorocitrate, SML0540, and PDTC, respectively, also by i.t. The Western blot assay was performed to assess the protein levels of HMGB1, RAGE, TLR4, Iba1, and GFAP and the Elisa assay to assess the levels of HMGB1, TNF-α, and IL1-β. The results indicate the participation of RAGE and TLR4 receptors, microglia, astrocytes, and MAPK p38 and NFkB signaling in both HMGB1-induced nociception and paclitaxel-induced neuropathic pain. It was also observed an increase in HMGB1 protein levels in the genesis of neuropathic pain, and the involvement of TLR4 receptors in microglial activation. Blockade of RAGE and TLR4 receptors led to a decrease in pro-inflammatory cytokines. These results indicate that HMGB1 released in the initial paclitaxel treatment activates RAGE and TLR4 receptors in microglia, increasing levels of pro-inflammatory cytokines and contributing to neuropathic pain.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Investigação da participação espinhal dos receptores TRPV1 na ativação da via PI3K/AKT/mTOR durante a dor pós-operatória em camundongos
    (Universidade Federal de Alfenas, 2024-02-05) Santos, Gabriela Xavier; Souza, Giovane Galdino De; Marinho, Bruno Guimarães; Silva, Morgana Duarte Da
    Aproximadamente 86% dos indivíduos submetidos a um tipo de cirurgia reportam sentir dor pós-operatória (DPO), a qual a intensidade da dor é frequentemente moderada a severa, iniciando de maneira aguda e podendo se tornar crônica. Além disso, poucos mecanismos têm sido descritos na literatura que elucidam a gênese da DPO. Diante desse contexto, o presente estudo investigou a participação do receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1 (TRPV1) a ativação da via PI3K/AKT/mTOR na medula espinhal de camundongos submetidos a um modelo DPO. Para tal, foram utilizados camundongos machos (20-25g) da linhagem C57BL6. O modelo de DPO utilizado foi o de incisão e retração de pele e músculo (IRPM) e o limiar nociceptivo foi avaliado pelo teste de von Frey filamentos. Para a avaliação farmacológica da via PI3K/AKT/mTOR e do receptor TRPV1 na DPO, os animais receberam por via intratecal bloqueador e inibidores específicos para TRPV1, PI3K, AKT, mTOR os quais foram administrados no 14º dia de DPO, seguido da avaliação do limiar nociceptivo. No 14° dia os animais que receberam administração intratecal dos inibidores da via PI3K/AKT/mTOR e o bloqueador do TRPV1 apresentaram aumento do limiar nociceptivo. Na análise biomolecular, a expressão de PI3K p110ᵞ e AKT (Thr 308) não foram modificadas após DPO. No entanto, foi observado aumento da expressão dos receptores TRPV1 (p<0,05) e p-mTOR (Ser 2481) (p<0,05) comparado ao grupo naive. De acordo com os resultados obtidos, nós sugerimos o envolvimento da via PI3K/AKT/mTOR e do receptor TRPV1 na fisiopatologia da DPO, porém o aumento dos níveis de expressão da via PI3K/AKT/mTOR, pelo receptor TRPV1 não foi observada
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Investigação do efeito do canabidiol sobre a ativação de células da glia em modelos de nocicepção induzida por paclitaxel e LPS
    (Universidade Federal de Alfenas, 2020-07-30) Santos, Rafaela Silva Dos; Souza, Giovane Galdino De; Soncini, Roseli; Moreira, Fabrício De Araújo; Nunes, Pedro Henrique Gobira; Ceron, Carla Speroni
    Ao longo da vida, a dor tanto de característica aguda quanto crônica, é uma das razões para a maior frequência de visitas médicas e um dos motivos mais comuns para o uso medicamentos, além de ser uma das principais causas de incapacidade no trabalho. A dor crônica afeta o funcionamento físico e mental, a qualidade de vida e a produtividade dos indivíduos afetados. Estudos têm demonstrado que a dor causa ativação das células da glia com aumento da expressão do Tool-like receptors (TRL4). Os TLR4 reconhecem ligantes endógenos e exógenos DAMPS (padrões moleculares associados ao dano) e PAMPS (padrões moleculares associados a patógenos) não só envolvidos com a infecção ou lesão, mas também com outros processos fisiopatológicos como a dor. Assim várias estratégias de tratamento têm sido desenvolvidas para controlar esse sintoma, como o tratamento com canabidiol (CBD), um ficanabinóide. Os receptores canabinóides do tipo 2 (CB2), expressos em tecidos periféricos e células inflamatórias, parecem estar envolvidos na antinocicepção induzido pelo CBD. Além disso, estudos tem demonstrado que tais receptores também estejam expressos no Sistema Nervoso Central (SNC), incluindo células gliais. Sendo assim, o presente estudo investigou o efeito do CBD na dor neuropática induzida por paclitaxel (PTX) e na nocicepção induzida por lipopolissacarídeo (LPS). Para isso, foram utilizados camundongos Swiss, pesando entre 25 a 30g. O limiar nociceptivo foi avaliado pelo teste de filamentos de Von frey. O modelo de dor neuropática foi induzido pela injeção intraperitoneal de PTX e o modelo de nocicepção induzido por PAMP, pela injeção intratecal de LPS. Para verificar os níveis de citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α foi realizado o ensaio de ELISA. Foram utilizadas as drogas, AM630, para investigar a participação de receptores CB2, a dosagem de anandamida (AEA) e 2- araquidonoilglicerol (2-AG), para avaliar a participação de endocanabinóides, a minociclina e o fluorocitrato, para investigar o envolvimento da micróglia e do astrócito e o LPS-RS para verificar a participação do receptor TRL4. Também foi realizado o ensaio de wester blot para averiguar o efeito do CBD sobre os niveís da expressão do receptor CB2, IBA-1, GFAP e TRL4, além da imunofluorescência para avaliar a co-localização dos receptores CB2/TRL4 no corno da raiz dorsal da medula espinhal. Após 4 dias de tratamento com PTX, os animais apresentaram uma alodínia mecânica e esta foi revertida pelo CBD. O mesmo ocorreu com o os animais que foram tratados com LPS, a alodínia mecânica foi revertida pelo CBD. O AM630 inibiu a antinocicepção induzida pelo CBD, em ambos os modelos nociceptivos. O CBD aumentou os níveis de AEA e 2-AG na medula espinhal nos modelos estudados. A minociclina e o fluorocitrato bloquearam a nocicepção nos dois modelos. O LPS-RS também inibiu a nocicepção nos dois modelos. Os resultados do ensaio de ELISA demonstraram que o CBD reduziu os níveis de TNF-α e IL-1β nos modelos estudados. O CBD aumentou a expressão do CB2 no modelo de nocicepção induzido pelo PTX e não teve efeito no modelo de nocicepção induzido por LPS, reduziu os níveis de IBA-1 no modelo de nocicepção induzido por PTX e não teve efeito no modelo de nocicepção induzido por LPS. Na expressão de GFAP, o CBD não apresentou efeito em nenhum dos modelos e na expressão de TRL4, o CBD reduziu sua expressão no modelo de nocicepção induzido por PTX e não teve efeito no modelo de nocicepção induzido por LPS. Sendo assim, concluímos que o CBD reduz a nocicepção nos modelos induzidos por PTX e pelo LPS, o sistema endocanabinóide participa desse efeito e as células da glia parecem estar envolvidas na gênese e manutenção da dor, pela ativação do TRL4, com consequente liberação de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β.