Mestrado em Biociências Aplicadas à Saúde

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A mudança de hospedeiro é acompanhada de alterações morfológicas no besouro do feijão Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Chrysomelidae: Bruchinae)
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-02-21) Cruz, Bruno De Oliveira; Barchuk, Angel Roberto; Teixeira , Isabel Ribeiro Do Valle; Simões, Zilá Luz Paulino
Em insetos fitófagos, como os coleópteros Bruchinae, a escolha da espécie vegetal para alimentação está associada a combinações fenotípicas complexas. Porém, a escassa literatura não permite identificar padrões evolutivos. Sabe-se menos ainda das mudanças adaptativas na troca de hospedeiros, e não são conhecidos os aspec-tos que governam a capacidade reprodutiva destes insetos, mesmo que seja esta característica que determina o sucesso dessas espécies em infestar grãos. Buscando investigar eventuais alterações morfológicas e reprodutivas no processo adaptativo, ao longo de três gerações, foram avaliadas as variações de corpo e das gônadas associadas com a mudança de hospedeiro de oviposição utilizando como modelo o caruncho do feijão, Zabrotes subfasciatus. Para tanto, os insetos foram submetidos a medições geracionais, com protocolo de fluorescência para gônadas. Populações do inseto mantidas em feijão (Phaseolus vulgaris) foram permitidas ovipositar em grão-de-bico (Cicer arietinum) para estabelecimento do experimento de seleção. As análi-ses morfométricas revelaram comprimentos, largura e espessura de corpo, compri-mento de élitro, comprimento de abdome exposto e largura do pronoto maiores em populações de grão-de-bico (p < 0,05). As gônadas foram analisadas sob fluorescên-cia com DAPI-faloidina e revelaram que as fêmeas nascidas em grão-de-bico produ-zem altas quantidades de ovócitos e tendem a mantê-los no cálice de seus ovários em mais de 70% dos casos (p < 0,05). Em conjunto, nossos resultados sugerem que o uso de um novo hospedeiro por Z. subfasciatus é possibilitado por alterações mor-fológicas associadas ao desenvolvimento de life-history traits, particularmente, capa-cidade reprodutiva.
Acesso aberto (Open Access)
Determinantes moleculares da diferenciação inicial do cérebro em castas de abelhas Apis mellifera
(Universidade Federal de Alfenas, 2014-05-20) Vieira, Joseana; Barchuk, Angel Roberto; Oliveira, Jaqueline Carvalho De; Tanaka, Érika Donato
O desenvolvimento do cérebro é influenciado por ambos os fatores genéticos e ambientais. Entre os últimos, a dieta tem sido considerada de um papel fundamental. Demonstramos recentemente que em abelhas, larvas de rainha, que são alimentadas com grandes quantidades de geléia real, experimentam o maior e mais rápido desenvolvimento do cérebro do que as de operárias. Também mostramos que esta morfogênese diferencial é evidente a partir do 4º estágio larval (L4). Esta constatação implica que uma grande ingestão de alimento impulsiona o desenvolvimento do sistema nervoso. Estudos recentes mostraram que a composição de geleias real e de operária diferem entre si, levando a diferenças no padrão da expressão gênica. Alguns miRNAs são mais abundantes na geléia de operárias que na geleia real durante o desenvolvimento larval inicial, sugerindo um papel para estas pequenas moléculas na determinação de castas. Como não há diferenças morfológicas entre cérebro de rainhas e operárias antes de L4, a hipótese é de que as primeiras diferenças observadas são molecularmente promovidas no início do desenvolvimento. Neste estudo temos o objetivo de identificar genes que respondem a alimentação em cérebros de rainhas e operárias na fase larval L3. Utilizando seqüenciamento de nova geração (RNA-Seq) identificamos 60 genes diferencialmente expressos (GDEs), 31 mais expressos em operárias e 29, em rainhas. Os produtos de sete transcritos super-expressos em rainhas já foram associados com atividade neuronal: aromatic-L-amino-acid decarboxylase-like, Spatzle-2, three serine proteases (SP25, SP33 and SPH41), apolipoprotein D-like, and forked. Oito dos genes super-expressos em operárias estão envolvidos na inibição de proteínas que promovem desenvolvimento cerebral ou são importantes para o desenvolvimento de características desta casta: chymotrypsin inhibitor-like, chymotrypsin inhibitor, GB51989 (domínio conservado pacifastin), três hexamerinas (hex-110, -70c e -70b) e citocromo P450 9Q1 e nesprin 1-like. Além disso, doze genes, dos 60, estão localizados no cromossomo 15, sugerindo a co-regulação deste grupo de genes. Análises da complexa rede sugere que muitos dos DEG são alvos de miRNAs presentes nas geleias, portanto, fazem parte de uma complexa via que leva ao desenvolvimento do difenismo observado no cérebro em castas de abelhas.
Acesso aberto (Open Access)
Influência do farnesol exógeno sobre aspectos fisiológicos de abelhas Apis mellifera
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-01-23) Coelho Júnior, Valdeci Geraldo; Barchuk, Angel Roberto; Zavan, Bruno; Nunes, Francis De Morais Franco
Tanto humanos como outros animais frequentemente entram em contato com moléculas produzidas por plantas e que podem regular direta ou indiretamente suas fisiologias. No modelo de estudo Apis mellifera, as operárias forrageadoras coletam néctar, pólen e resinas vegetais. No sul de Minas Gerais, a planta Baccharis dracunculifolia apresenta em suas resinas o farnesol, precursor importante da via de síntese do Hormônio Juvenil (HJ), hormônio que governa vários aspectos da vida de insetos. Hipotetizamos que, durante o forrageamento, as operárias entram em contato com quantidades significativas de precursores de HJ que, uma vez dentro do corpo, podem ser modificados e convertidos em HJ. Esta interferência com a via de síntese endógena de HJ nestes insetos pode promover alterações fisiológicas e comportamentais com implicações biológicas, ecológicas e agrícolas. Para testar esta hipótese, avaliamos a influência de farnesol exógeno sobre parâmetros fisiológicos de abelhas operárias jovens. Para isso, dissecamos corpora allata (CA), órgão responsável pela síntese de HJ, em dois grupos de abelhas, tratados por três dias: (I) 50 abelhas que receberam 1g de alimento contendo mel, açúcar e farnesol, diluído em óleo de canola, e (II) 50 abelhas que receberam 1g de alimento contendo mel, açúcar e óleo de canola (controle). Por meio de RT-qPCR determinamos o perfil de transcrição dos genes metil farnesoato epoxidase (mfe), metil transferase (mt) e farnesil difosfato sintase (fpps3), envolvidos na via de síntese do HJ, e do gene esterase do hormônio juvenil (jhe), responsável pela degradação do HJ. Nossos resultados mostram que o gene mfe é mais expresso em indivíduos controle em relação aos suplementados com o farnesol exógeno; em contramão, para o gene jhe foi encontrado o inverso. Isto indica-nos que quanto mais farnesol uma abelha consumir, menor será a síntese de precursor direto de HJ e maior a degradação de HJ. Ademais, abelhas tratadas com farnesol tiveram seus volumes de CA, incluindo área e diâmetro dos núcleos, maiores em relação às abelhas controles. Analisamos, ainda, o comportamento nos dois grupos durante 72 h, e observamos que abelhas com 48 h de vida suplementadas com farnesol movimentavam-se de forma mais ativa em relação às do grupo controle. Estes achados demonstram que a agentes exógenos, como o farnesol sintetizado por plantas, alteram a fisiologia, metabolismo e comportamento de abelhas melíferas.
Embargo
O farnesol tópico altera parâmetros comportamentais, morfológicos e moleculares de operárias jovens de abelhas Apis mellifera
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-08-29) Silva, Raissa Bayker Vieira; Barchuk, Angel Roberto; Teixeira, Isabel Ribeiro Do Valle; Bitondo, Marcia Maria Gentile
Os organismos vivos entram em contato diariamente com moléculas que são liberadas no meio ambiente, tanto por animais como por plantas, em uma ação conhecida como interação química ambiental. Essa interação pode, eventualmente, provocar alterações na fisiologia, morfologia e comportamento dos organismos. Algumas plantas, por exemplo, a espécie Baccharis dracunculifolia, conhecida popularmente como alecrim-do-campo, contém farnesolem sua resina. Este sesquiterpeno é um importante precursor da via de síntese do hormônio juvenil (HJ), substância que governa vários aspectos da vida dos insetos. Hipotetizamos que, durante o forrageamento, as operárias de abelhas Apis mellifera entram em contato com quantidades significativas de precursores de HJ que, uma vez dentro do corpo, podem ser modificados e convertidos em HJ. Estudos prévios de nosso grupo mostraram que operárias jovens que consomem farnesol fornecido na dieta ingerem mais alimento, são mais agressivas, possuem as glândulas corpora allata (CA, local de síntese de HJ) maiores, incluindo o diâmetro dos núcleos celulares, e mostram alterações nos perfis de transcrição de genes que codificam enzimas da via de síntese e degradação de HJ. Aqui fornecemos o farnesol por via tópica em operárias adultas jovens de A. mellifera para analisar sua influência sobre a biologia, desacoplando seu eventual efeito indireto sobre a taxa de ingestão desses insetos. Para isso, realizamos uma série de experimentos utilizando dois grupos de abelhas operárias recém emergidas (24 h): (Grupo I) 50 abelhas receberam a solução de farnesol diretamente no tórax (testamos 3 diferentes concentrações: 10 μg, 2 μg e 0,2 μg); e (Grupo II) 50 abelhas que receberam acetona (controle). As abelhas foram mantidas em estufa por 72 h, a 36o C e 80% de umidade relativa. Para avaliar os efeitos do farnesol sobre a morfologia dos CA, estes foram dissecados e processados mediante histologia em historesina, Para estimar os efeitos do farnesol sobre a via de síntese/degradação e resposta ao HJ, determinamos (usando qPCR) o nível de transcrição de genes codificadores para as enzimas metil farnesoato epoxidase (mfe) e metiltransferase (mt) esterase do hormônio juvenil (jhe), Krüppel homólogo - Kr h1, Metoprene-Tolerant - Met e TAI). Nossos resultados evidenciam que o farnesol tópico não causa alterações no consumo de alimento em abelhas jovens. No entanto, em doses altas (10 μg), se mostra tóxico, causando um aumento na mortalidade do grupo tratado. Observamos também que o farnesol tópico influencia o comportamento das abelhas jovens (aumento de movimentação), principalmente nas primeiras 48 horas após o tratamento, e promove alterações nos parâmetros morfométricos dos CA em abelhas tratadas, pois apresentam um tamanho maior (área e volume) dessas estruturas em relação ao grupo controle. As análises de níveis de transcrição mostraram que os genes mfe e mt, representantes da via de síntese do hormônio juvenil (HJ), e os genes de resposta ao HJ (Jhe, Krüppel homólogo - Kr h1, Metoprene-Tolerant - Met e TAI), foram mais expressos nos grupos tratados com farnesol em comparação com os grupos controle. Portanto, concluímos que o farnesol promove alterações comportamentais, morfológicas e fisiológicas em abelhas jovens de Apis mellifera, possivelmente, ao ser utilizado como precursor para a síntese de HJ ou mediante ação semelhante ao próprio HJ. As alterações morfológicas dos CA e as alterações nos níveis de expressão de genes da via de síntese de HJ em abelhas tratadas com farnesol apoiam a primeira explicação.
Acesso aberto (Open Access)
Pipeline para a análise in silico de genes diferencialmente expressos durante o desenvolvimento de abelhas apis mellifera – o caso do knock-down da esterase do hormônio juvenil
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-11-11) Pereira, Denis; Barchuk, Angel Roberto; Ávila, Paulo Muniz De; Vieira, Joseana
Diante do grande aumento da disponibilidade de dados de sequenciamento de ácidos nucléicos, uma área interdisciplinar chamada bioinformática tem contribuído muito para as pesquisas em análise computacional de sequências de DNA, RNA e proteínas. A bioinformática tornou mais ágil a análise de RNA para identificação da expressão diferencial, possibilitando a criação de pipelines cada vez mais eficientes. Em abelhas Apis mellifera, a determinação de castas começa com a alimentação diferencial no terceiro instar (fase do desenvolvimento) larval. As larvas fêmeas destinadas a se tornarem rainhas são alimentadas com geléia real e as operárias recebem uma proporção menor de geléia real misturada com mel e pólen. Essa dieta ativa diferentes respostas endócrinas nas castas, resultando no estímulo de vias distintas de expressão gênica que culmina no desenvolvimento de rainhas e operárias. Uma das respostas endócrinas moduladas pela alimentação diferencial são os títulos de hormônio juvenil (HJ) que são mais altos nas larvas destinadas a se tornarem rainhas. As diferenças nos títulos de HJ entre rainhas e operárias são reguladas tanto pelo nível de síntese deste hormônio nos corpora allata, quanto pela sua degradação mediada pela esterase do hormônio juvenil (JHE). Com o objetivo de determinar os mecanismos moleculares dependentes de jhe direta e indiretamente no desenvolvimento larval, membros de nosso grupo de pesquisa realizaram ensaios funcionais em operárias de A. mellifera. Os experimentos consistiram no silenciamento do gene jhe por RNA de interferência no estágio larval L2. Foram coletadas amostras de RNAs de indivíduos tratados (dsRNA-jhe) e controles (naïve) no 5º instar larval e sequenciadas. Os arquivos contendo as sequências foram disponibilizadas. O objetivo de nosso trabalho foi desenvolver um pipeline de análise in silico para a identificação de genes diferencialmente expressos entre as abelhas controle e as abelhas tratadas com dsRNA-jhe. Para isto, primeiramente, usamos o programa FASTQC para determinar a qualidade das reads, que apresentaram altos valores phred score. As sequências de adaptadores identificadas pelo FASTQC e as reads com comprimento menor que 10 nt foram removidas usando o programa CUTADAPT. Em seguida, as bibliotecas foram mapeadas no genoma da A. mellifera com a ferramenta BWA. As bibliotecas apresentaram um mapeamento em torno 85% das reads gerando como saída arquivos no formato SAM. Posteriormente, estes arquivos foram convertidos em BAM usando o programa SAMTOOLS, os quais foram utilizados pelo programa CUFFLINKS para a identificação de genes diferencialmente expressos (GDEs). Foram encontrados 458 GDEs, sendo destes 151 menos expressos e 307 genes mais expressos nas abelhas tratadas (dsRNA-jhe) em relação às abelhas controle. Os resultados revelaram genes que respondem ao aumento nos títulos endógenos de HJ em resposta ao silenciamento da jhe durante o desenvolvimento larval de A. mellifera. Estes resultados se assemelham aos resultados obtidos pela aplicação tópica de HJ em larvas de operárias, previamente publicados por nosso grupo de pesquisa. Além disto, os resultados demonstram a viabilidade do pipeline desenvolvido para a análise da expressão gênica diferencial em sistemas biológicos.
Acesso aberto (Open Access)
Testando a hipótese do cérebro social: modelo Frieseomelitta varia
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-07-31) Santos, Gabriele David Dos; Barchuk, Angel Roberto; Lourenço, Anete Pedro; Zavan, Bruno
A hipótese do cérebro social afirma que o cérebro de espécies sociais teria evoluído em resposta a influências ambientais, tais como competição, proteção e procura de alimento, resultando assim na cooperação entre os indivíduos e aumento da complexidade social. Desta forma, têm-se desafios cognitivos que espécies solitárias não enfrentam. Esta hipótese tem sido bem estudada em vertebrados, particularmente no ser humano e em aves. Os insetos sociais possuem algumas características em comum quanto à sua biologia. Uma delas é a existência de divisão do trabalho reprodutivo, com uma ou umas poucas fêmeas encarregando-se da produção de ovos (rainhas) e o resto desenvolvendo atividades de manutenção da colônia (operárias). Em abelhas Apis mellifera, as operárias adultas possuem cérebros e regiões cerebrais proporcionalmente maiores que as rainhas, o que sugere que nessa espécie a hipótese do cérebro social é válida, já que o investimento no desenvolvimento do cérebro permite que os membros desta casta desenvolvam funções bem variadas dentro da colônia. Além disso, estudos do nosso laboratório mostraram que um grupo de genes diferencialmente expressos entre as castas medeiam a neurogênese diferencial nestes insetos. Neste trabalho, avaliamos os alcances da hipótese do cérebro social em abelhas, testando-a na abelha nativa sem ferrão Frieseomelitta varia, outra espécie social. Hipotetizamos que nesta abelha as diferenças de castas sejam promovidas por trade-off morfofisiológicos do desenvolvimento, como ocorre em abelhas africanizadas. Assim, nosso objetivo foi determinar os padrões morfogenéticos e moleculares do desenvolvimento cerebral pós-embrionário em castas de F. varia, por meio de técnicas histológicas de inclusão em historesina para morfometria, e ensaios de biologia molecular para determinar o perfil transcricional dos genes selecionados. Nossos resultados morfológicos mostraram que o volume total do cérebro em operárias Re é maior quando comparado a rainhas na mesma fase. Os corpos cogumelares e os corpos pedunculares também mostraram resultados interessantes, sendo o volume das neurópilas do hemisfério esquerdo maiores que as do direito em operárias. Alguns estudos apontam que o hemisfério esquerdo estaria relacionado à memória a longo prazo, fato interessante por se tratar de operárias, que desempenham inúmeras funções dentro de uma colônia. Três dos nove genes neurogênicos que em A. mellifera são casta-específicos (amci, amd e SPH41) são possíveis candidatos à genes ortólogos entre F. varia e humanos. Estes genes podem atuar na manutenção e desenvolvimento sistema nervoso já no início da embriogênese, e na síntese de metabólitos envolvidos em processos nervosos e cognitivos de abelhas, como dopamina e serotonina. Nossos dados moleculares revelaram que hex70b e hex70c são mais transcritos no cérebro de operárias no início do desenvolvimento pupal (Pp), sugerindo que estas proteínas, em F. varia, guiam o desenvolvimento de operárias mesmo nas fases pós-larva; o amci também se mostrou mais expresso em operárias Pp, permanecendo assim até Pbm. Este resultado evidencia o papel das serina proteases durante a formação do sistema nervoso, podendo este gene contribuir para o maior desenvolvimento do cérebro de operárias e possivelmente participando como regulador das funções sinápticas necessárias para o desenvolvimento e melhoramento da cognição em operárias. Nossos resultados permitem concluir que a hipótese do cérebro social é aplicada tanto a abelhas A. mellifera quanto a F. varia e que as diferenciações morfológicas do cérebro são promovidas pela expressão diferencial de genes neurogênicos, alguns deles, funcionalmente conservados em abelhas e vertebrados.
The social brain hypothesis states that the brain of social species would have evolved in response to environmental influences, such as competition, protection, and food demand, resulting in cooperation between individuals and increased social complexity. In this way, there are cognitive challenges that solitary species do not face. This hypothesis has been studied in vertebrates, particularly in humans and birds. Social insects have some commonalities in their biology, like the existence of division of reproductive labor, with one or a few females taking care of eggs production (queens) and the rest developing activities in maintenance of the colony (workers). In Apis mellifera bees, adult female workers have brains and brain regions proportionally larger than queens, suggesting that in this species the social brain hypothesis is valid, since the investment in brain development allows the members of this caste to perform well varied within the colony. In addition, studies from our laboratory have shown that a group of differentially expressed genes among the castes mediate the differential neurogenesis in these insects. In this work we evaluate the reach of the social brain hypothesis in bees, testing it on the native bee Frieseomelitta varia, another social species. We hypothesized that in this bee caste differences are promoted by morphological and developmental trade-off, as occurs in Africanized bees. Thus, our goal was to determine the morphogenetic and molecular patterns of post-embryonic brain development in F. varia, using histological inclusion techniques for morphometry, and molecular biology assays to determine the transcriptional profile of the selected genes. Our morphological results showed that the total brain volume in Ne workers is higher when compared to queens in the same phase. Mushroom bodies and peduncular bodies also showed interesting results, the volume of left hemisphere neurons being larger than those of workers. Some studies indicate that the left hemisphere would be related to long-term memory, an interesting fact because it is workers, who perform many functions within a colony. Three of the nine neurogenic genes that in A. mellifera are casta-specific (amci, amd and SPH41) are possible candidates for orthologous genes between F. varia and human. These genes can act in the maintenance and development nervous system already in the beginning of the embryogenesis, and in the synthesis of metabolites involved in nervous and cognitive processes of bees like dopamine and serotonina. Our molecular data showed that hex70b and hex70c are more transcribed in workers' brain at early pupal development (Pp), suggesting that these proteins in F. varia guide the development of workers even in the post-larva stages; the amci was also more expressed in workers Pp, thus remaining until Pbm. This result evidences the role of serine proteases during the formation of the nervous system, which may contribute to the greater development of the brain of workers and possibly participate as a regulator of the synaptic functions necessary for the development and improvement of cognition in workers. Our results allow us to conclude that the social brain hypothesis is applied to both A. mellifera and F. varia and the morphological differentiations of the brain are promoted by the differential expression of neurogenic genes, some of them functionally conserved in bees and vertebrates.
Acesso aberto (Open Access)
Transcrição diferencial e morfogênese do cérebro adulto de castas de abelhas Apis mellifera
(Universidade Federal de Alfenas, 2014-08-22) Oliveira, Márcio Tadeu De; Barchuk, Angel Roberto; Moda, Lívia Maria Rossatto; Tanaka, Erica Donato
Aprendizagem e habilidades relacionadas com a memória são utilizadas pelas abelhas adultas para efetuar a navegação, o forrageamento e outras atividades, que estão associadas com a região central do cérebro, que é relativamente mais desenvolvida nas operárias do que em rainhas. Durante o período larval, no entanto, a alimentação diferencial oferecida as potenciais rainhas promovem o desenvolvimento cerebral mais rápido e a expressão de genes neurogênicos (ataxin-2, cryptocephal, dachshund, Eph Receptor, failed axon connection, short stop e tetraspanin 5D). Acontece que, em algum momento do estágio pupal, essa tendência é modificada. Há evidências, de que o cérebro da rainha experimenta taxas relativamente maiores de morte cellular, enquanto que, a operária é favorecida por altas taxas de proliferação cellular, resultando cérebros específicos nas castas. No presente trabalho, nós relatamos resultados transcriptômicos que possam representar as bases moleculares do desenvolvimento diferencial do cérebro entre as castas. Análises de genoma em larga escala utilizando o microarray de oligonucleotídeos revelam um padrão oposto ao observado durante o período larval, com maiores níveis de transcrição no cérebro de operárias de 324 genes (por exemplo, mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor, minibrain, signal peptide peptidase e tumbleweed, todos associados a eventos neurogênicos ou a prevenção da morte cellular). Isso sugere que de alguma forma os respectivos produtos dos genes promovam o desenvolvimento diferencial do cérebro de abelhas. MANF, por exemplo, um gene superexpresso no cérebro de operárias codifica uma proteína com um domínio homólogo à SAP Ku70 C-terminal. Uma vez que essa molécula é um inibidor da proteína apoptótica Bax, MANF é um candidato a atuar como um fator anti-apoptótico durante o desenvolvimento cerebral (eventos de extensa morte cellular são característicos no cérebro de pupas de rainhas). Minibrain codifica uma proteína-quinase envolvida na regulação da divisão celular durante a neurogênese pós-embrionária, e é outro candidato a participar no mecanismo responsável pela inversão da taxa de tamanho do cérebro/ volume corporal entre rainhas e operárias. Além disso, foi avaliado por RT-qPCR o perfil de transcrição das variants A e B do ecdysone receptor (mediador da ação dos hormônios edisteróides e provavelmente está envolvido na morte celular diferencial e na proliferação de células do cérebro das castas) em três estágios do desenvolvimento pupal. Nossos resultados sugerem a existêcia de um limiar hormônio/receptor, onde excesso de hormônio, em rainhas, é desencadeado mais morte celular do que eventos de proliferação, que por meio da participação de genes efetores, acarretariam as diferenças morfológicas no cérebro adulto entre rainhas e operárias.

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