Mestrado em Engenharia Química

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Imobilização da biomassa catalítica de Aspergillus oryzae IPT-301, caracterização e aplicação na produção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-05-28) Garcia, Rogério Lopes; Perna, Rafael Firmani; Maiorano, Alfredo Eduardo; Hirata, Daniela Battaglia
Os frutooligossacarídeos (FOS) são açúcares de baixa caloria que apresentam diversos benefícios à saúde humana. São disponibilizados comercialmente mediante produção sintética, por reação de transfrutosilação, utilizando enzimas microbianas como a frutosiltransferase (FTase, E.C.2.4.1.9). Dentre os micro-organismos produtores desta enzima, o Aspergillus oryzae IPT-301 se destaca como fonte potencialmente produtora, sintetizando FTase micelial (aderida a biomassa celular) com atividades hidrolítica (AH) e de transfrutosilação (AT). A razão entre as atividades (AT/AH) é um importante parâmetro que indica a predominância de AT sobre AH. A aplicação deste micro-organismo na produção de FOS pode ser aprimorada por meio da imobilização da biomassa por processo de reticulação visando aumentar a estabilidade da biomassa e possibilitar o seu reuso. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho centrou-se na imobilização da biomassa de Aspergillus oryzae IPT-301 utilizando glutaraldeído como agente de reticulação e caracterização quanto às suas propriedades catalíticas, assim como a determinação dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos e avaliação de sua estabilidade operacional na produção de FOS. A biomassa catalítica foi produzida por fermentação submersa aeróbia, em agitador orbital do tipo Shaker e meio de cultura sintético. Os ensaios de imobilização da biomassa produzida foram realizados por planejamento experimental do tipo DCCR 2² e o efeito de diferentes concentrações de glutaraldeído (GLU) e pH no meio de imobilização foram avaliados. As melhores respostas foram obtidas em pH 7,9 e concentração de GLU 2,1 % (v/v), com AT e AH iguais a 821 ± 28 U.g-1 e 126 ± 10 U.g-1, respectivamente. Quando comparado o ganho de atividade por unidade de massa micelial com o processo de imobilização, foi observado um aumento de 14 % na AT, redução de 40 % na AH e aumento em 86 % da razão (AT/AH). Estas mudanças nas atividades observadas após a imobilização são benéficas por favorecerem maiores rendimentos deste biocatalisador na produção de FOS. Assim, as biomassas livre e imobilizada foram caracterizadas. A biomassa livre apresentou os melhores resultados de atividade entre as temperaturas de 45 ºC e 55 ºC, enquanto as maiores AT e razão (AT/AH) para a biomassa imobilizada foram observadas entre 50 ºC e 55 ºC. Quanto à influência do pH, ambos os biocatalisadores apresentaram maiores AT e razão (AT/AH) em pH 5,5. Desta forma, a temperatura de 50 ºC e o pH 5,5 foram fixados para se realizar a comparação dos biocatalisadores nos ensaios de estabilidade operacional. Os ensaios de estabilidade frente ao pH mostraram que ambos os biocatalisadores foram estáveis na faixa de pH entre 4,5 e 7,5. A análise de estabilidade térmica mostrou por meio dos parâmetros termodinâmicos avaliados que a imobilização da biomassa proporcionou um aumento da termoestabilidade, com a biomassa imobilizada passando a ter um tempo de meia vida a 50 ºC de 5728,5 min, valor este 2,8 vezes maior que o observado para o tempo de meia vida da biomassa livre a 50 ºC. A avaliação da cinética enzimática indicou que os modelos de Hill e de Michaelis-Menten se ajustaram satisfatoriamente ao comportamento da FTase de ambos os biocatalisadores. Foi observada a redução de K0,5, de 97,8 para 85,9 g.L-1 e uma redução de Km, de 121,5 para 98,5 g.L-1 após a imobilização da biomassa catalítica, indicando um aumento da afinidade entre enzima e substrato com a imobilização. A aplicação dos biocatalisadores em ensaios de estabilidade operacional mostrou que a biomassa imobilizada foi estável após 12 ciclos de produção de FOS (atividade relativa de 88,9 ± 2,2 % da atividade inicial), enquanto a atividade da biomassa livre caiu após 12 ciclos de produção para aproximadamente 50 % da atividade inicial, demonstrando assim o ganho de aplicabilidade da biomassa catalítica de Aspergillus oryzae IPT-301 na produção de FOS com o processo de imobilização realizado.
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Imobilização da enzima frutosiltransferase extracelular de Aspergillus oryzae IPT-301 em sílica gel pura e funcionalizada para produção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-10-07) Prado, José Pedro Zanetti; Perna, Rafael Firmani; Soares, Cleide Mara Faria; Villalba Morales, Sergio Andres
Frutooligossacarídeos (FOS) são açúcares prebióticos de baixa caloria, não cariogênicos, podendo ser consumidos por diabéticos e, por não serem hidrolisados pelas enzimas gastrointestinais, promovem a seletividade das bactérias probióticas na microbiota intestinal, auxiliando na eliminação de microrganismos patogênicos e na prevenção do câncer de cólon. São comercialmente produzidos por enzimas microbianas como a frutosiltransferase (FTase, E.C.2.4.1.9) utilizando a sacarose como substrato. A imobilização destas enzimas em suportes porosos, permite aumentar a estabilidade enzimática, reutilizar o biocatalisador e proteger a enzima de condições adversas do meio reacional. Diante disso, este trabalho teve como objetivo imobilizar, por adsorção física e ligação covalente, a FTase extracelular de Aspergillus oryzae IPT-301 em sílica gel, pura (sem tratamento) e funcionalizada com glutaraldeído, visando obter um biocatalisador heterogêneo ativo e estável para a produção de FOS. Avaliou-se as estabilidades térmica, frente ao pH de incubação, operacional e de armazenamento da enzima imobilizada, bem como os perfis cinéticos do biocatalisador. As melhores condições obtidas para a imobilização de FTase em sílica gel pura (35 ºC, pH 5,5 e 175 rpm) e em sílica gel funcionalizada com glutaraldeído foram empregadas para se determinar o rendimento de imobilização (RI) e a atividade recuperada (AR). Para a FTase imobilizada em sílica gel pura, alcançou- se valores de RI e AR iguais a 13 % e 10 %, respectivamente, ao passo que, para a enzima imobilizada no suporte funcionalizado, foram obtidos RI de 38 % e AR de 7,5 %. A enzima imobilizada em ambos os suportes apresentou comportamento cinético descrito pelo modelo corporativo de Hill, cujos maiores valores de atividade foram obtidos para uma faixa de concentração de substrato compreendida entre 400 g L-1 e 600 g L-1. A FTase imobilizada em sílica gel funcionalizada mostrou maior capacidade de reutilização ao longo de 8 ciclos reacionais consecutivos, além de exibir maiores estabilidades térmica, de armazenamento e frente ao pH em relação ao biocatalisador adsorvido no suporte puro. Os resultados obtidos sugerem um alto potencial de aplicação da sílica gel funcionalizada como suporte de imobilização de FTase para a produção de FOS.
Acesso aberto (Open Access)
Imobilização da enzima frutosiltransferase extracelular de Aspergillus oryzae IPT-301 em sílica-gel para produção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-03-08) Faria, Larissa Lemos; Perna, Rafael Firmani; Morales, Sergio Andres Vilalba; Ottoni, Cristiane Angélica
Os frutooligossacarídeos (FOS) são açúcares prebióticos de baixa caloria que apresentam diversos benefícios à saúde humana. Há um grande interesse na aplicação de FOS como substitutos dos edulcorantes convencionais, o que torna necessário o desenvolvimento de processos, em escala industrial, de produção destes componentes, desenvolvidos no Brasil. Estes açúcares podem ser produzidos pela reação de transfrutosilação da sacarose, catalisada por enzimas microbianas como a frutosiltransferase (FTase E.C.2.4.1.9), de Aspergillus oryzae IPT-301. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo estudar o processo de imobilização da enzima FTase microbiana extracelular, utilizando sílica-gel como suporte, para produção de FOS. Para tanto, foram realizados testes de imobilização, por adsorção física, em diferentes temperaturas (20 ºC, 25 ºC, 30 ºC e 35 ºC), durante 6 horas, com agitação de 175 rpm, 10 mL de caldo fermentado pH 5,5, contendo a enzima microbiana extracelular, e 1,0 g de sílica-gel. Após obter os perfis cinéticos de adsorção, foi realizado um planejamento experimental do tipo delineamento composto central rotacional (DCCR) 2² variando a temperatura e pH do meio reacional, com o intuito de definir as condições ótimas de reação para a enzima imobilizada. Em acrésccimo, para a caracterização do biocatalisador imobilizado, foram realizados ensaios de estabilidade frente ao pH, estabilidade térmica, avaliação da influência da concentração de substrato na reação enzimática e ensaios de estabilidade operacional. Os perfis cinéticos de imobilização indicaram que a atividade de transfrutosilação (), presente no caldo fermentado, decresceu com o aumento do tempo de imobilização e que, o maior rendimento de imobilização, cerca de 85 %, foi obtido para uma temperatura de 35 ºC. A partir do planejamento experimental, foi possível definir as condições ótimas de reação para a enzima imobilizada obtendo-se valores de pH e temperatura iguais a 5,5 e 50 ºC, respectivamente. A avaliação da concentração de substrato indicou que as melhores condições para a reação enzimática foram alcançadas para concentrações de sacarose compreendidas entre 400 a 600 g.L-1 e a cinética enzimática foi melhor ajustada ao modelo cooperativo de Hill. Além disso, os ensaios de estabilidade ao pH mostraram que a enzima imobilizada foi estável ( relativa próximo a 100 %) na faixa de pH entre 5,0 e 6,5 e, a análise de estabilidade térmica mostrou, por meio dos parâmetros termodinâmicos avaliados, que a imobilização proporcionou um aumento na energia necessária para a desativação enzimática, aumentando sua termoestabilidade, de modo a aumentar o tempo de meia vida da enzima FTase imobilizada em 2,5 vezes, para a temperatura de 30ºC, em relação ao biocatalisador na sua forma livre. Dos ensaios de estabilidade operacional, constatou-se que a enzima pode ser reutilizada por 2 ciclos batelada consecutivos sem perdas de atividade. Ao caracterizar o suporte sílica-gel foi possível comprovar a adsorção da enzima em sua superfície. Portanto, a partir dos estudos de imobilização e caracterização foi possível concluir que a FTase extracelular foi satisfatoriamente imobilizada em sílica-gel.
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Imobilização de células de Aspergillus oryzae IPT-301 em esponja de poliuretano para a produção enzimática de fruto-oligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-12-16) Barbosa, Nathália Romani; Perna, Rafael Firmani; Maiorano, Alfredo Eduardo; Miranda, Everson Alves
Fruto-oligossacarídeos (FOS) são oligômeros de frutose benéficos à saúde e nutrição humana por exibirem propriedades nutracêuticas. Sua produção ocorre por reação de transfrutosilação em moléculas de sacarose catalisadas por enzimas frutosiltransferases (FTase, E.C.2.4.1.9) aderidas às células microbianas. A imobilização de células em materiais de suporte permite obter biocatalisadores heterogêneos robustos e resistentes às condições adversas do meio reacional. Esponjas de poliuretano (EPU) são suportes indicados para a imobilização por apresentarem estabilidades térmica e mecânica, além de tamanho e distribuição de poros que possibilitam a difusão gasosa e de substrato, essenciais para o crescimento microbiano. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de células de Aspergillus oryzae IPT-301, por cultivo celular submerso, e sua imobilização concomitante em esponjas de EPU. Para isso, foram investigados a capacidade de crescimento e adsorção das células em função do tempo de cultivo e da atividade de transfrutosilação (AT), assim como realizados estudos de caracterização das propriedades bioquímicas e de estabilidade das células imobilizadas e imobilizadas e reticuladas, visando obter biocatalisadores robustos, estáveis e ativos para a síntese de FOS. A produção das células microbianas, confinadas em EPU, ocorreu em meio de cultura sintético, pH 5,5, 200 rpm à 30 ºC. A curva de crescimento microbiano mostrou que o melhor tempo de cultivo celular ocorreu para 32 h de processo. A temperatura de 50 ºC, o pH de 5,5 e a concentração de 480,2 g L-1 foram os parâmetros do meio reacional que forneceram os máximos valores de AT. A avaliação da cinética enzimática mostrou que o modelo de Hill se ajustou satisfatoriamente aos perfis cinéticos apresentados para ambos os biocatalisadores. Parâmetros termodinâmicos indicaram que as células imobilizadas proporcionaram um aumento da termoestabilidade do biocatalisador. Os ensaios de estabilidade frente ao pH mostraram que ambas as células (imobilizadas e imobilizadas e reticuladas) mantiveram estáveis em uma faixa de pH entre 4,5 e 6,0 e retiveram até 40 % de AT inicial quando armazenadas por 28 dias sob refrigeração. Por fim, os resultados de estabilidade operacional indicaram que as células imobilizadas e imobilizadas e reticuladas retiveram 50,23% e 60,90% de suas atividades enzimáticas iniciais, respectivamente, após 12 ciclos reacionais consecutivos, alcançando uma produção média de 100 g L-1 de FOS. Esse conjunto de resultados evidencia a potencialidade da aplicação de células catalíticas, imobilizadas em EPU, na produção de FOS e representa o início de uma sequência de estudos sobre a imobilização dessas células microbianas, por adsorção, em diferentes materiais de suporte para a obtenção de biocatalisadores na síntese de bioprodutos de interesse industrial e na implementação de bioprocessos diversos.
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Imobilização de células de Aspergillus Oryzae IPT-301 em esponja vegetal para a síntese enzimática de fruto-oligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-08-23) Aranda, Isabela Almodova; Perna, Rafael Firmani; Perna, Rafael Firmani; Zanin, Gisella Maria; Basso, Rodrigo Corrêa
Fruto-oligossacarídeos (FOS) são classificados como açúcares prebióticos que apresentam diversos benefícios à saúde e nutrição humana. São sintetizados industrialmente, por reação de transfrutosilação em moléculas de sacarose catalisadas por enzimas frutosiltransferases aderidas às células microbianas. A imobilização de células em materiais de suporte possibilita obter biocatalisadores heterogêneos robustos e resistentes às condições adversas do meio reacional. Esponjas vegetais são suportes indicados para a imobilização por apresentarem tamanho e distribuição de poros que possibilitam a difusão gasosa e de substrato, essenciais para o crescimento microbiano. Além disso, são suportes biodegradáveis e de baixo custo. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de células de Aspergillus. oryzae IPT-301 e sua imobilização em esponja vegetal. Para isso, a produção das células microbianas, imobilizadas em esponja vegetal, ocorreu em meio de cultura sintético, pH 5,5, 200 rpm à 30 ºC. A curva de crescimento microbiano mostrou que o melhor tempo de cultivo celular ocorreu para 28h de processo. A temperatura de 50 ºC, o pH de 5,75 e a concentração de 400 g L-1 foram os parâmetros do meio reacional que forneceram máximas atividades enzimáticas. As células biocatalíticas imobilizadas exibiram maior termoestabilidade quando comparadas às células biocatalíticas in natura, conforme indicado pelos valores dos parâmetros termodinâmicos obtidos para o biocatalisador heterogêneo. Além disso, as células imobilizadas em esponja vegetal apresentaram ampla faixa de estabilidade frente ao pH (5,00 a 7,00) e bom desempenho operacional. Ensaios em reator de leito fixo mostraram uma produtividade enzimática de 11,7 U g-1 min-1, cujos valores de conversão e rendimento obtidos foram iguais a 8,31% e 6,63%, respectivamente. Quanto ao valor do parâmetro produtividade mássica, obteve-se 1,89 g FOS gcélulas-1 h -1 para o sistema reacional contínuo. Esse conjunto de resultados evidencia a inovação tecnológica presente neste estudo para a obtenção de biocatalisadores a partir da imobilização de células em esponja vegetal, tanto para a síntese de FOS, quanto no avanço do segmento de bioprodutos de interesse industrial e na implementação de bioprocessos diversos.
Acesso aberto (Open Access)
Imobilização de células íntegras de Aspergillus oryzae IPT-301 visando estudos biocatalíticos em reator de leito fixo para a produção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-02-14) Ribeiro, Beatriz Menossi; Perna, Rafael Firmani; Maiorano, Alfredo Eduardo; Sipoli, Caroline Casagrande
Frutooligossacarídeos (FOS) são açúcares prebióticos de baixa caloria que apresentam diversos benefícios à saúde e nutrição humana. São disponibilizados comercialmente mediante produção sintética, por reação de transfrutosilação, utilizando enzimas microbianas como a frutosiltransferase (FTase, E.C.2.4.1.9) e sacarose como substrato. Dentre os microrganismos potencialmente produtores destas enzimas, destaca-se o Aspergillus oryzae IPT-301, sintetizando FTase micelial (enzima aderida às células microbianas) com elevada atividade de transfrutosilação (AT). Atualmente, a produção de FOS é conduzida em biorreatores batelada, um processo lento e oneroso. Portanto, torna-se necessário a implementação de sistemas de reação contínuos, em reatores de leito fixo (PBR), que aumentem o volume de produção de FOS e diminuam seus custos de produção. Logo, o uso de biocatalisadores na forma de células íntegras para a produção do açúcar torna-se vantajoso por exibirem suporte natural para a própria enzima. Diante disso, este trabalho teve como objetivo imobilizar, por reticulação com glutaraldeído, células íntegras de A. oryzae IPT-301 e avaliar seus efeitos biocatalíticos quando empacotadas em reator de leito fixo (PBR), visando obter elevada atividade enzimática para a produção de FOS. Inicialmente, buscou-se desenvolver o biocatalisador por meio da produção e imobilização das células íntegras microbianas e, posteriormente, implementar o processo contínuo de produção do açúcar em reator PBR, para avaliação dos efeitos biocatalíticos da biomassa imobilizada. Para o desenvolvimento do biocatalisador, investigou-se a influência das variáveis de imobilização (pH, temperatura, concentração de glutaraldeído e velocidade de agitação) na atividade AT por diferentes técnicas de planejamento experimental. A partir das melhores condições de imobilização alcançadas (pH 7,9; 25 ºC, 200 rpm e 2,1 % v v-1 de glutaraldeído), foram investigados diferentes tempos de reação (30, 45, 60, 75 e 90 min) para o processo, obtendo-se os maiores valores de AT ao se reticular a biomassa microbiana por 45 min. Os resultados obtidos mostram o desenvolvimento promissor de um biocatalisador com elevada atividade enzimática. Para a implementação das células íntegras reticuladas em reator PBR, avaliou-se a influência da altura do leito catalítico (20, 15 e 10 cm), da temperatura do meio reacional (30, 40, 50 e 60 ºC), da concentração de substrato (200, 300, 400, 473, 500 e 600 g L-1) e da vazão volumétrica (1,0, 2,0, 3,0, 4,0 e 5,0 mL min-1) nos perfis de AT. Também foram obtidos os parâmetros cinéticos mediante ajustes do modelo cinéticos aos dados experimentais e, por fim, realizados estudos de transferência de massa externa (TME) e ensaios de estabilidade operacional, na ausência e presença de corrente de reciclo, no reator PBR. Foram alcançados os melhores perfis de atividade enzimática para o reator recheado com 20 cm de leito catalítico, contendo células íntegras reticuladas com diâmetro equivalente de 2,58 ± 0,3 mm, operado a 50 ºC e alimentado com solução de sacarose de 473 g L-1, pH 5,5, a uma vazão de 1,0 mL min-1. A cinética enzimática foi melhor ajustada ao modelo de Michaelis-Menten. Observou-se ainda que a reação foi limitada pelos efeitos de TME. Os ensaios de estabilidade operacional mostraram que, ao se implementar a corrente de reciclo no reator, obteve-se um aumento de 60 % na AT relativa, cuja atividade enzimática máxima foi mantida a partir de 540 min de reação. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que a implementação do processo contínuo, visando a produção de FOS, mostrou-se promissora ao se alcançar perfis elevados de atividade enzimática em reator PBR recheado com células íntegras reticuladas.
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Imobilização de frutosiltransferase extracelular de Aspergillus oryzae IPT-301 em polihidroxibutirato e sua caracterização bioquímica para a produção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-11-26) Araújo, Isabella Medeiros; Perna, Rafael Firmani; Zanin, Gisella Maria; Maiorano, Alfredo Eduardo
Fruto-oligossacarídeos (FOS) se referem aos oligômeros de frutose, cujas unidades frutosil são ligadas na posição β (2→1) da molécula de sacarose, o que os distingue dos demais oligômeros. Os FOS, também conhecidos como “açúcares não convencionais”, apresentam excelentes características funcionais em alimentos, além de seus aspectos físicos e fisiológicos. Estes açúcares podem ser produzidos de forma natural, por enzimas presentes em vegetais, ou por enzimas microbianas, dentre as quais tem-se a frutosiltransferase (FTase E.C.2.4.1.9), de Aspergillus oryzae IPT-301, que atua como o biocatalisador da reação de transfrutosilação da sacarose. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo estudar o processo de imobilização da enzima FTase microbiana extracelular, utilizando o polihidroxibutirato (PHB) como suporte, nas formas pura e funcionalizada com glutaraldeído, visando à produção de FOS. Para tal, foram realizados testes de imobilização, por adsorção física e ligação covalente, na temperatura de 35 ºC, durante 8 horas, com agitação de 175 rpm, 10 mL de caldo fermentado, pH 5,5, contendo a enzima microbiana extracelular, e 1,0 g de suporte puro e funcionalizado. Para estudos de caracterização do biocatalisador imobilizado, foram realizados ensaios de estabilidade frente ao pH de incubação (4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 e 7,0), estabilidade térmica (30 ºC, 40 ºC, 50 ºC e 60 ºC), avaliação da influência da concentração de substrato na reação enzimática (200 g L-1, 300 g L-1, 400 g L-1, 470 g L-1, 500 g L-1 e 600 g L-1), ensaios de estabilidade operacional e estabilidade ao armazenamento. Os perfis cinéticos de imobilização indicaram que a atividade de transfrutosilação (𝐴𝑡), presente no caldo fermentado, decresceu com o aumento do tempo de imobilização e que, o maior rendimento de imobilização foi cerca de 41 ± 6 %, para a FTase adsorvida no suporte puro e 55 ± 4 % para a FTase imobilizada no suporte funcionalizado, após 8 horas de imobilização. Além destes, foram encontrados valores de 17 ± 3 % e 11 ± 2 % paras as atividades recuperadas (AR) para a enzima imobilizada nos suportes puro e funcionalizado, respectivamente. Desse modo, foram definidas as condições de imobilização para ambas as formas de suporte: temperatura de 35 ºC, pH 5,5, agitação de 175 rpm e 8 h de imobilização. Os maiores valores de 𝐴𝑡 foram obtidos na concentração de sacarose de 400 g L-1 para a FTase imobilizada em PHB puro e funcionalizado e o modelo de Hill foi ajustado aos dados para a imobilização da FTase em ambos os suportes. A enzima imobilizada em PHB funcionalizado apresentou maiores estabilidades térmica, operacional e ao armazenamento que a FTase imobilizada em PHB puro. A FTase imobilizada em PHB funcionalizado apresentou retenção de atividade de 56,83 ± 4,38 % após seis ciclos batelada, enquanto a enzima adsorvida em PHB puro apresentou retenção de 41,29 ± 3,24 % da atividade incial. Portanto, a partir dos estudos de imobilização e caracterização, foi possível concluir que a FTase extracelular foi adequadamente imobilizada em PHB puro e funcionalizado, com melhores resultados para a enzima ligada ao biopolimero funcionalizado.
Acesso aberto (Open Access)
Implementação de reator de leito fixo empacotado com biomassa catalítica de Aspergillus oryzae IPT-301 para a produção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2020-03-27) Dias, Giancarlo De Souza; Perna, Rafael Firmani; Maiorano, Alfredo Eduardo; Rolemberg, Marlus Pinheiro
Frutooligossacarídeos (FOS) são açúcares prebióticos de baixa caloria que apresentam diversos benefícios à saúde humana. São disponibilizados comercialmente mediante produção sintética, por reação de transfrutosilação, utilizando enzimas microbianas como a frutosiltransferase (FTase, E.C.2.4.1.9) e sacarose como substrato. Dentre os microrganismos potencialmente produtores destas enzimas, destaca-se o Aspergillus oryzae IPT-301, sintetizando FTase micelial (enzima aderida a biomassa microbiana) com elevada atividade de transfrutosilação (At). Atualmente, a produção de FOS é conduzida em biorreatores em batelada, um processo lento e oneroso. Portanto, torna-se necessária a implementação de sistemas de reação contínuos, em reatores de leito fixo (PBR), que aumentem o volume de produção de FOS e diminuam seus custos de produção. Para isso, o uso de biocatalisadores na forma de células íntegras (biomassa catalítica) para a produção do açúcar torna-se vantajoso por exibirem suporte natural para própria enzima. Diante deste contexto, este trabalho propôs implementar um sistema de reação contínuo em reator PBR, empacotado com biomassa catalítica de Aspergillus oryzae IPT-301, visando obter elevada atividade de transfrutosilação para a produção de FOS. Para isso, buscou-se, inicialmente, avaliar a influência dos parâmetros de projeto (diâmetro das esferas de biomassa e altura do leito catalítico) no tempo médio de residência, por meio da caracterização da Distribuição do Tempo de Residência (DTR). Entretanto, por se tratar de um leito poroso, foi necessário saturar a biomassa catalítica com azul de metileno (AM) para reduzir os erros associados a adsorção do corante no leito catalítico. Posteriormente, foi estudada a influência da temperatura do meio reacional (40 ºC, 50 ºC e 60 ºC), da concentração de sacarose (173 g L-1 a 573 g L-1) e da vazão volumétrica de alimentação de substrato (5,0 mL min-1 a 20,0 mL min-1) nos perfis de atividade de transfrutosilação. Também foram obtidos os parâmetros cinéticos mediante ajustes dos modelos de Michaelis-Menten e Hill aos dados experimentais e, por fim, realizados estudos de transferência de massa interna (TMI) e externa (TME) assim como ensaios de estabilidade operacional com e sem reciclo no reator PBR. Para a saturação da biomassa catalítica in situ, foram necessários dois ciclos de adsorção/purga e, como a melhor condição de projeto, obteve-se um leito catalítico de 13,0 cm de altura constituído por esferas de biomassa de 6,0 ± 0,4 mm de diâmetro. Os melhores perfis de atividade enzimática foram obtidos operando o reator PBR a 50 ºC, alimentado com solução de sacarose de 473 g L-1, pH 5,5, a uma vazão volumétrica de 11,5 mL min-1. A cinética enzimática foi melhor ajustada ao modelo de Michaelis-Menten. Sob essas condições, permitiu-se observar que a reação não foi limitada pelos efeitos de TMI e TME. Os ensaios de estabilidade operacional mostraram, nos primeiros 420 min de reação, uma redução de 25 % na atividade enzimática, mantendo-se estável após esse período. Comparado ao processo batelada, sob as mesmas condições operacionais, verificou-se que o processo contínuo apresentou os melhores resultados para a atividade de transfrutosilação e estabilidade operacional. Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que a implementação do processo contínuo, para a produção de FOS, mostrou-se promissora ao se alcançar perfis elevados de atividades enzimáticas em reator PBR recheado com biomassa catalítica microbiana.
Acesso aberto (Open Access)
Implementação de reator de leito fixo empacotado com células de Aspergillus oryzae IPT - 301 imobilizadas em esponja de poliuretano para a produção enzimática de fruto-oligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-12-15) Cardoso, Mariana Ferreira Martins; Perna, Rafael Firmani; Silvério, Sara Isabel Da Cruz; Xavier, Michelle Da Cunha Abreu
Os fruto-oligossacarídeos (FOS) possuem uma ampla gama de aplicações na indústria alimentícia devido às suas propriedades fisiológicas e funcionais. Sua produção ocorre por reação de transfrutosilação em moléculas de sacarose catalisadas por enzimas frutosiltransferases (FTase, E.C.2.4.1.9) aderidas às células microbianas. A imobilização de células em materiais de suporte permite obter biocatalisadores heterogêneos robustos e resistentes às condições adversas do meio reacional. Esponjas de poliuretano (EPU) são suportes indicados para a imobilização por apresentarem estabilidades térmica e mecânica, além de tamanho e distribuição de poros que possibilitam a difusão gasosa e de substrato, essenciais para o crescimento microbiano. Atualmente, a produção de FOS é conduzida em biorreatores batelada, um processo lento e oneroso. Portanto, torna-se necessário a implementação de sistemas reacionais contínuos, em reatores de leito fixo (PBR) que aumentem o volume de produção de FOS e diminuam seus custos operacionais. Diante disso, este trabalho propôs implementar um sistema reacional contínuo para a produção de FOS em reator PBR a partir de células de Aspergillus oryzae IPT-301 imobilizadas em EPU, utilizando sacarose comercial como substrato, com fluxo de alimentação ascendente. Para isso, o reator foi empacotado com as células microbianas cultivadas e concomitantemente imobilizadas, por processo batelada, em matrizes cúbicas de EPU utilizando meio de cultura sintético, pH 5,5, 200 rpm, 30 ºC por 32 h. Para o processo contínuo, foram avaliados a influência da vazão volumétrica (1,0 mL.min-1 a 10,0 mL.min-1), concentração de substrato (200 g.L-1 a 600 g.L-1), temperatura do meio reacional (30 ºC a 60 ºC) e massa do leito biocatalítico nos perfis de atividade de transfrutosilação (AT). Por fim, foram realizados estudos de estabilidade operacional com e sem reciclo no reator PBR por 12 h de reação. A condição operacional que proporcionou os maiores valores de AT utilizando a concentração de sacarose de 400 g.L-1, para a reação enzimática conduzida a 50 ºC, pH 5,5 com o reator empacotado com 0,8g de células microbianas imobilizadas. Contudo, a mesma apresentou sobrecarga operacional, sendo escolhida a vazão de 1mL.min-1 para os ensaios subsequentes. Os resultados de estabilidade operacional mostraram valores de AT elevados e estáveis ao decorrer da reação, alcançando-se produtividades de FOS iguais a 115,0 g.L-1.h-1 e 5,0 g.L-1.h-1 no reator operado com e sem corrente de reciclo, respectivamente. Os resultados mostraram que a implementação de um sistema reacional contínuo pode se tornar promissor para a síntese enzimática de FOS.
Acesso aberto (Open Access)
Implementação de reator de leito fixo recheado com biomassa microbiana encapsulada em alginato para a produção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2020-05-08) Prata, Mateus Galvão; Perna, Rafael Firmani; Xavier, Michelle Da Cunha Abreu; Villalba Morales, Sergio Andres
Frutooligossacarídeos (FOS) são oligômeros de cadeia curta, constituídos por polímeros de frutose ligados à sacarose. Os FOS são classificados como prebióticos devido aos excelentes benefícios fisiológicos ocasionados pela sua ingestão regular. Os resultados promissores alcançados pela aplicação de frutosiltransferases (FTase) procedentes do fungo Aspergillus oryzae micelial imobilizado em matriz de alginato de cálcio na produção de FOS em regime batelada, subsidiam a transposição do processo para o regime de fluxo contínuo. Diante disso, este trabalho propôs a implementação de um reator de leito fixo (PBR) enzimático aplicado na produção de FOS via reação de transfrutosilação. A influência da temperatura e da vazão na atividade enzimática foi investigada por meio de delineamento composto central rotacional com triplicata no ponto central. Foi realizado, ainda, o estudo dos efeitos da concentração de substrato e da vazão volumétrica de alimentação na atividade do biocatalisador e obtidos os parâmetros cinéticos da reação enzimática. Os parâmetros de transferência de massa foram estimados e avaliou-se a estabilidade operacional do processo na ausência e presença de reciclo. As superfícies de resposta e curvas de contorno foram construídas e obteve-se, como os melhores parâmetros operacionais, a reação conduzida a 50°C, com o reator alimentado com solução de sacarose 400g.L-1 a uma vazão de 7,5mL.min-1. A respeito da cinética enzimática, os dados experimentais foram ajustados pelo modelo corporativo de Hill, indicando afinidade positiva entre enzima e substrato. O coeficiente de transferência de massa externo (k_c=1,0x10^(-2) m.s^(-1)) e o fator efetividade (η_m=0,974)η_m, calculado para a transferência de massa interna à partícula, comprovaram a baixa limitação imposta pelas etapas de transporte mássico à taxa de desenvolvimento da reação. O estudo da estabilidade operacional indicou retenção de 96 % da atividade enzimática após 12h de processo. Portanto, pode-se concluir que a implementação de reator PBR, recheado com biocatalisador encapsulado em gel de alginato de cálcio, mostrou-se promissora para a aplicação na produção enzimática de FOS.
Acesso aberto (Open Access)
Integração energética aplicada a uma planta de fertilizantes visando a redução de consumo de utilidades quente e fria
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-02-26) Madureira, Celso Dias; Perna, Rafael Firmani; Santos Júnior, Iraí; Rolemberg, Marlus Pinheiro; Lisboa, Antônio Carlos Luz
Neste trabalho foi realizado o diagnóstico energético de uma planta real de fertilizantes, localizada no Estado de São Paulo, composta por seis unidades industrias: 02 (duas) de produção de ácido nítrico diluído, 02 (duas) de concentração de ácido nítrico, 01 (uma) de produção de nitrato de amônio e 01 (uma) de produção de nitrato de amônio perolado. Nesta planta, buscou-se reduzir o consumo de utilidades quente e fria por meio da aplicação, em cada unidade, da integração energética. O princípio desta técnica está fundamentado na maximização da eficiência energética da planta visando reduzir os custos com energia e combustível no processo e, consequentemente, a diminuição do custo final dos produtos, tornando-os mais competitivos no mercado. Apesar da literatura abordar vastamente o tema, poucos são os trabalhos que apresentam a aplicação da integração energética em processos químicos reais e não há registros dessa ferramenta aplicada em plantas integradas de nitrato de amônio, o que confere a originalidade do presente estudo. Atualmente, cerca de 20,5 % do vapor utilizado na planta industrial é importado de uma planta vizinha o que gera um custo estimado de aproximadamente 5,4 milhões de reais por ano. Por meio da identificação das principais correntes envolvidas nos processos juntamente com suas respectivas características como vazão, temperatura e composição, foi proposto um modelo de balanços de massa e energia para simular a condição atual da planta e estimar o seu consumo de utilidades. O modelo apresentou desvios relativos de 7,6 % e 9,6 % para as utilidades quente e fria, respectivamente, desvio este considerado satisfatório para o trabalho. A partir deste modelo, realizou-se a integração energética das unidades mediante uso prioritário de condensados de vapor de cada unidade para aquecimento das correntes frias de processo, além da integração energética entre as correntes de processo, quando possível, na própria planta, evitando-se a integração energética entre unidades. Para a Planta de Ácido Nítrico Diluído II (PAND II) foi proposta a geração de vapor utilizando duas caldeiras de recuperação de calor. Com a integração energética foi confirmada a possibilidade de redução de 100 % do consumo de vapor importado e de 11,4 % da água de resfriamento, atingindo uma economia anual de aproximadamente R$ 5,6 milhões, o que representa 81,4 % dos custos de utilidades. Por meio da análise do fluxo de caixa, alcançou-se um valor de TIR de 168,49 % com um payback descontado de 8,4 meses, para uma taxa de desconto de 14 % a.a. por um período de 20 anos, desprezando a depreciação dos equipamentos.
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Produção e caracterização da enzima frutosiltransferase de Aspergillus oryzae IPT-301 visando a obtenção de frutooligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-05-12) Cunha, Josivan De Sousa; Perna, Rafael Firmani; Miranda, Everson Alves; Hirata, Daniela Battaglia; Tardioli, Paulo Waldir
Os frutooligossacarídeos (FOS) são oligômeros de frutose, cujas unidades frutosil estão ligadas na posição β-(2→1) na molécula de sacarose. Esses açúcares, de baixa caloria, são classificados com prebióticos, não são cariogênicos, podem ser usados por diabéticos, são de 0,4 a 0,6 vezes menos doce que a sacarose, sendo amplamente utilizados pelas indústrias farmacêutica e de alimentos como açúcares funcionais. Apesar dos FOS serem produzidos naturalmente por enzimas presentes em diversos vegetais, são disponibilizados comercialmente por meio da produção sintética, utilizando enzimas de origem microbiana como as frutosiltransferases (FTases, E.C.2.4.1.9) e sacarose como principal substrato. Diante deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a produção de FTases extracelular e micelial de Aspergillus oryzae IPT-301 por fermentação submersa aeróbia utilizando meio de cultura sintético, assim como a caracterização e estudos cinéticos das enzimas produzidas. Também foram investigados os efeitos da temperatura e pH do meio reacional nas atividades enzimáticas mediante técnica de planejamento experimental. Para a produção de FTases foi necessário o cultivo do micro-organismo em meio de cultura estéril e a fermentação foi conduzida em agitador orbital do tipo shaker. Com o caldo de fermentação filtrado e o micélio úmido foi possível determinar as atividades de transfrutosilação (quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de FOS por minuto nas condições experimentais) e hidrolítica (quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de frutose por minuto nas condições experimentais) extracelular e micelial, respectivamente, para as diferentes condições experimentais avaliadas. A concentração máxima de biomassa celular obtida foi de 9,35 ± 1,26 g.L-1 em 48 h de fermentação, sendo que em 76 h, houve a produção de 7,51 ± 1,57 g.L-1, período em que ocorreu a acidificação do caldo fermentado (pH 4,82). As condições nas quais a enzima extracelular obteve maior atividade de transfrutosilação foi aquela produzida em 64 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional de 50 °C, concentração de sacarose a partir de 296,0 g.L-1, apresentando estabilidade entre 30 e 35 ºC e em pH 6,0. Por outro lado, a FTase micelial mostrou sua máxima atividade quando produzida em 72 h de fermentação, incubada na faixa de pH 4,5-6,0, temperatura reacional entre 45-55 °C, concentração de substrato igual a 470,6 g.L-1, indicando estabilidade para faixas de pH entre 6,0-8,0 e temperatura entre 30-40 ºC. A FTase extracelular apresentou cinética michaeliana em relação à concentração de substrato, exibindo valores de Vmax igual a 16,23 U.mL-1 e Km de 50,41 g.L-1 , enquanto a FTase micelial ajustou-se satisfatoriamente ao Modelo de Hill, cujos valores dos parâmetros Vmax, K0,5 e n foram iguais a 342,23 U.g-1 e 234,73 g.L-1 e 1,41, respectivamente. O estudo da influência do tempo e da temperatura reacional na síntese de FOS mostrou que a FTase extracelular produziu maior concentração de FOS a 50 °C, enquanto a FTase micelial a 40°C. A otimização do processo para a obtenção de FOS comprovou que a zona ótima da FTase extracelular (em que elevada atividade de transfrutosilação e baixa atividade hidrolítica são esperadas) ocorreu nas faixas de temperatura entre 45-50 °C e de pH entre 5,5-6,75. Para a FTase micelial, apenas a atividade de transfrutosilação ajustou-se satisfatoriamente ao modelo quadrático com interação, cuja zona ótima ocorreu em temperaturas superiores a 46 °C e valores de pH abaixo de 6,5. Os resultados obtidos atestaram que o fungo se destacou como fonte produtora de FTases e, estas, por sua vez, mostraram-se promissoras para a obtenção de FOS em escala laboratorial.
Acesso aberto (Open Access)
Síntese, modelagem, simulação e análise técnica-econômica de uma planta de produção de biocatalisadores heterogêneos para obtenção de fruto-oligossacarídeos
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-12-08) Silva, Guilherme Ferreira Da; Perna, Rafael Firmani; Elias, Andrew Milli; Rolemberg, Marlus Pinheiro
Os fruto-oligossacarídeos (FOS) são açúcares prebióticos de baixa caloria que promovem uma série de benefícios à saúde e nutrição humana e animal. Podem ser produzidos pela reação de transfrutosilação em moléculas de sacarose, catalisada por enzimas frutosiltransferases (FTase E.C.2.4.1.9) aderidas às células microbianas. O uso da enzima solúvel na produção de FOS pode causar instabilidade na estrutura tridimensional quando isolado do seu ambiente natural e possível perda de atividade devido às condições do processo ou inibição pelo substrato e/ou produto. Com isso a imobilização de células em materiais de suporte permite obter biocatalisadores heterogêneos robustos com elevada atividade, especificidade e seletividade, ao passo que a reticulação das células imobilizadas permite produzi-los com maior estabilidade operacional, possibilitando a aplicação em sistemas reacionais contínuos. As esponjas de poliuretano (EPU) são suportes indicados para a imobilização de células por apresentarem estabilidades térmica e mecânica, além de tamanho e distribuição de poros que possibilitam a difusão gasosa e de substrato, essenciais para o crescimento microbiano. Neste contexto, propõe-se realizar a síntese, modelagem, simulação, análise técnica-econômica (ATE) e de sensibilidade de uma planta de produção de biocatalisadores heterogêneos visando a síntese de FOS a partir de células de Aspergillus oryzae IPT-301, com atividade de transfrutosilação, imobilizadas em cubos de EPU. As simulações foram realizadas no software EMSO para os cenários envolvendo células imobilizadas e reticuladas em EPU (Cenário A) e apenas para células imobilizadas em EPU (Cenário B) mediante o processamento de 4,5 kg/h de sacarose VHP (Very High Polarization) utilizada como substrato. No cenário A foram obtidos 2,776 kg/h do biocatalisador heterogêneo com gasto energético de 6,298 kW, enquanto no cenário B foram produzidos 2,789 kg/h do biocatalisador com gasto energético de 6,167 kW. Para ambos os cenários, obteve-se uma produtividade de 2,812 kg/m3 .h do biocatalisador heterogêneo. Os processos apresentaram elevados custos de produção, acarretando um preço mínimo de venda maior que o valor proposto de 420 US$/kg para o cenário A (437,285 US$/kg) e 210 US$/kg para o cenário B (376,296 US$/kg). Além disso, ambos os cenários obtiveram um VPL negativo, tornando os processos inviáveis do ponto de vista econômico. Nas análises de sensibilidade, constatou-se que o cenário B necessita de uma grande alteração no preço de venda para ser economicamente viável. Entretanto, pequenas alterações nas variáveis do cenário A possibilitam tornar o processo viável, visto que as células imobilizadas e reticuladas em EPU apresentam maior atividade enzimática e, portanto, impactam positivamente no aumento da produção de FOS.

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Navegando Mestrado em Engenharia Química por Orientador(a) "Perna, Rafael Firmani"