Inibição da atividade catalítica da proteína dissulfeto isomerase por tempol

Especies reativas de oxigenio/nitrogenio (ERO/ERN) produzidas por neutrofilos atraves do complexo NADPH oxidase (Nox2) estao diretamente associadas as acoes deleterias surgidas quando a inflamacao escapa do controle da homeostase. A ativacao da NADPH oxidase de neutrofilos requer o acoplamento das subunidades citosolicas aos componentes de granulos e translocacao do complexo a membrana do fagossoma. A PDI (Proteina Dissulfeto Isomerase, EC 5.3.4.1) e uma chaperona envolvida no trafego proteico celular, sendo encontrada na superficie de diversas celulas procarioticas e eucarioticas. Trabalhos previos sugeriram que PDI pode ser um dos componentes responsaveis pela montagem de Nox2, facilitando o enovelamento correto das subunidades do complexo e/ou auxiliando o transito das subunidades ate a membrana do fagossoma. Neste trabalho foi testada a atividade de Nox2 de neutrofilos inflamatorios correlacionada a atividade redutase de PDI de membrana e o efeito do nitroxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxil (Tempol) sobre esses processos. Neutrofilos dormentes apresentaram baixa atividade de PDI e nao foi detectado consumo de oxigenio associado ao sistema Nox2, conforme ensaios realizados com uso de um pseudo-substrato para PDI e monitoramento com eletrodo de Clark, respectivamente. Sob estimulo de forbol (PMA), os fagocitos consumiram quantidade significativa de oxigenio (6.5„b0.58 nmol.min-1) e apresentaram alta atividade de PDI, cerca de quatro vezes maior que as celulas dormentes. Quando os fagocitos foram previamente tratados com Tempol houve decrescimo dose-dependente da atividade de Nox2 (ED50: 45 ƒÝg/106 neutrofilos), em correlacao direta com o decrescimo da atividade de PDI. Testes com inibidores padroes de PDI (bacitracina e acido ditionitrobenzoico- DTNB) confirmaram que a inibicao de PDI determina decrescimo da atividade de Nox2, resultados obtidos atraves de ensaios espectrofotometricos (reducao de citocromo c, 550 nm) e quimioluminescentes (sistema luminol-peroxidase). Em conjunto, os resultados apontam que, simultaneamente a atividade de Nox2 em neutrofilos estimulados, ocorre atividade redutase de PDI, confirmando que essa chaperona esta diretamente associada a ativacao e/ou manutencao da atividade da oxidase fagocitaria. Adicionalmente, esse trabalho mostrou que o nitroxido Tempol e capaz de modular negativamente a atividade de Nox2, cujo efeito, ao menos em parte, e decorrente da inibicao de PDI, sugerindo um novo mecanismo anti-inflamatorio dos nitroxidos.