Mestrado em Ciências Biológicas

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Navegando Mestrado em Ciências Biológicas por Orientador(a) "Castro, Lívia De Figueiredo Diniz"

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Avaliação dos efeitos do tratamento com ravuconazol em combinação com anlodipino na infecção experimental por Trypanosoma cruzi
    (Universidade Federal de Alfenas, 2018-07-26) Machado, Yara Almeida; Castro, Lívia De Figueiredo Diniz; Martins, Thais Viana Fialho; Marques, Marcos José
    A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, afeta cerca de 8 milhões de indivíduos. Não há tratamento etiológico eficaz e seguro para a fase crônica da infecção, o que motiva a busca por novas alternativas terapêuticas. Nesse sentido, a combinação de fármacos é uma estratégia promissora, principalmente quando utiliza fármacos já aprovados para uso clínico. O ravuconazol (Ravu) é um antifúngico que apresenta atividade anti-T. cruzi bem estabelecida in vitro e in vivo, no entanto não é eficaz em induzir cura parasitológica quando usado em monoterapia. O anlodipino (Anlo) é um bloqueador de canais de cálcio amplamente utilizado na clínica como anti-hipertensivo e estudos anteriores demonstraram sua atividade tripanossomicida. No presente estudo foram avaliados os efeitos de combinações de Ravu e Anlo na infecção experimental pela cepa Y de T. cruzi. Inicialmente foram realizados estudos in vitro para investigar o potencial citotóxico da combinação para as células hospedeiras e identificar a natureza da interação entre os fármacos sobre diferentes formas evolutivas do parasito. Para as avaliações in vivo, camundongos Swiss experimentalmente infectados ou não foram tratados por via oral durante 20 dias consecutivos com subdoses de ravuconazol (2,5 e 5 mg/Kg) isoladamente e em associação com 10 mg/Kg de anlodipino. A resposta ao tratamento foi avaliada considerando os parâmetros: supressão e reativação da parasitemia, mortalidade e detecção do DNA do parasito, por PCR, em amostras de sangue aos 60 dias após o tratamento. Ainda, foi avaliada a influência dos tratamentos nos perfis de citocinas e resposta humoral dos animais. Os resultados mostraram que não houve toxicidade adicional resultante da utilização combinada dos fármacos in vitro e o perfil de interação entre Ravu e Anlo foi dependente da forma evolutiva do parasito utilizada, sendo antagônica sobre formas tripomastigotas e sinérgica quando consideradas as amastigotas intracelulares. Os estudos em modelo murino mostraram que a administração da associação foi bem tolerada na ausência e presença da infecção. Altos níveis de parasitemia e 50% de mortalidade foram detectados nos camundongos infectados e não tratados. A administração de Ravu, em monoterapia ou combinado, induziu redução do parasitismo, sendo observada supressão da parasitemia durante todo o tratamento, protegendo os animais da mortalidade. Já o Anlo quando usado de forma isolada foi eficaz em reduzir o número de formas tripomastigotas detectadas no pico de parasitemia, mas não reduziu a mortalidade. De forma interessante, os tratamentos combinados foram eficazes em aumentar de duas a quatro vezes os índices de cura quando comparados às monoterapias com Ravu, evidenciando uma interação positiva entre fármacos in vivo. A análise dos níveis plasmáticos de IgG anti-T.cruzi confirmou os achados da avaliação parasitológica, com redução drástica da quantidade de anticorpos até 60 dias após o tratamento. Ainda, o perfil de citocinas identificado em amostras de soro dos animais infectados e tratados com a combinação foi semelhante ao identificado para os camundongos saudáveis. Os resultados permitem concluir que há efeito benéfico resultante da combinação de Ravu com Anlo no tratamento da infecção experimental aguda pela cepa Y de T. cruzi.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Desenvolvimento de uma estratégia de avaliação in vitro aplicável à verificação do potencial anti- Trypanosoma cruzi de candidatos a fármacos
    (Universidade Federal de Alfenas, 2021-02-25) Fernandes, Valquiria Angelis; Castro, Lívia De Figueiredo Diniz; Santos, Fabiane Matos Dos; Caldas, Ivo Santana
    A falha terapêutica observada nos estudos clínicos com os candidatos a fármacos tripanossomicidas mais promissores até então estudados evidenciaram a necessidade de maior compreensão sobre os fatores que interferem na seleção e análise de novos candidatos a fármacos para a doença de Chagas. No entanto, o valor translacional das estratégias de screening no âmbito da experimentação in vitro tem sido pouco explorado. Neste sentido, os objetivos do presente estudo são avaliar a influência do tipo celular hospedeiro na atividade anti- T. cruzi de fármacos e subsidiar a padronização de uma estratégia in vitro de alto valor translacional para identificação do potencial terapêutico de novas moléculas. Foram utilizadas duas linhagens celulares, Vero e H9c2, infectadas pela cepa Y de T. cruzi, incubadas ou não com fármacos de reconhecida ação tripanossomicida in vitro e in vivo, o benznidazol, medicamento de referência, e os candidatos, avaliados em estudos clínicos, fex- sulfona, ravuconazol e posaconazol. Este modelo foi utilizado primeiramente para determinação dos valores de EC-50 e EC-90 dos fármacos comparativamente nos dois tipos celulares em ensaios de 48 horas utilizando placas de 24 poços. Posteriormente, foi desenvolvido um ensaio em placas para verificar a supressão e a recrudescência do parasitismo após tratamento prolongado in vitro. Para padronização dessa estratégia foram utilizados os mesmos modelos celulares e fármacos, no entanto, as células foram mantidas em placas de 90mm e tratadas por 7 dias, quando foram submetidas ao washout. As placas foram avaliadas diariamente por microscopia óptica até 12 dias após o tratamento para detecção da recrudescência do parasitismo. Após esse período as células foram coletadas para a determinação da carga parasitária por qPCR. Os resultados obtidos sugerem que a atividade dos fármacos é influenciada pelo tipo celular, sendo os valores de EC-50 no mínimo duas vezes menor para a linhagem Vero. Esse perfil foi confirmado no ensaio de placas, no qual foi possível detectar supressão do parasitismo durante o tratamento com todos os fármacos e recrudescência após o tratamento com nitroimidazólicos em ambos os tipos celulares. No entanto, a recrudescência em H9c2 ocorreu anteriormente, e a carga parasitária detectada por qPCR pós-incubação com os nitroimidazólicos e ravuconazol foi significativamente menor nas células Vero. Os resultados obtidos sugerem que o tipo celular hospedeiro influencia na reposta do parasito aos fármacos e permitiram a identificação de uma estratégia in vitro aplicável à seleção de candidatos ao tratamento da doença de Chagas antes da progressão para estudos pré-clínicos in vivo.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Estudo de modelos experimentais aplicáveis à seleção de combinações de fármacos em avaliações pré-clínicas da doença de chagas
    (Universidade Federal de Alfenas, 2019-12-16) Raimundo, Breno Vilas Boas; Castro, Lívia De Figueiredo Diniz; Francisco, Amanda Fortes; Caldas, Sérgio
    Embora muitos avanços tenham sido realizados no âmbito da quimioterapia da doença de Chagas nos últimos anos, ainda não há tratamento com perfil satisfatório de eficácia e segurança para a fase crônica da infecção por Trypanosoma cruzi. O reposicionamento e a combinação de medicamentos têm se destacado como estratégias promissoras na busca de novas terapias. No entanto, paralelamente à busca por novas alternativas, é necessário aprimorar os modelos de avaliação pré-clínica existentes. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do ravuconazol em combinação com amiodarona sobre o desenvolvimento da infecção aguda por T. cruzi em diferentes modelos experimentais. Inicialmente foram realizados experimentos in vitro para determinar a toxicidade da combinação e a natureza da interação entre os fármacos sobre a infecção de células H9c2 pela cepa Y de T. cruzi. Posteriormente foram realizados experimentos in vivo utilizando diferentes linhagens de camundongos (Swiss e BALB/c) e cepas do parasito que apresentam graus variáveis de resistência ao tratamento etiológico (Y e Colombiana). Os animais infectados foram tratados a partir do 5o (cepa Y) ou 10o (cepa Colombiana) dia após a infecção durante 5 dias, por via oral, com ravuconazol (0,5mg/Kg) e amiodarona (50mg/Kg) em monoterapia e em combinação. Grupos controle contendo animais não infectados, infectados e não tratados, infectados e tratados com ravuconazol a 10mg/Kg ou benznidazol na dose de 100mg/Kg foram também incluídos. A parasitemia foi quantificada diariamente durante todo o período de realização do experimento. Cinco dias após o término do tratamento os animais foram eutanasiados e o coração coletado para análises histológicas. Os resultados obtidos permitiram confirmar a atividade tripanossomicida dos fármacos e identificar efeito aditivo resultante da combinação entre amiodarona e ravuconazol in vitro, na ausência de toxicidade adicional. In vivo, a amiodarona não foi eficiente em controlar a infecção pelas diferentes cepas do parasito, já o efeito do ravuconazol sobre a cepa Y foi dependente da dose e da linhagem de camundongo utilizada; enquanto a 10 mg/Kg o azólico suprimiu a parasitemia dos animais infectados pela cepa Y em ambas as linhagens, o efeito da subdose em controlar o parasitismo foi significativamente menor nos BALB/c. Por outro lado, a terapia combinada foi efetiva em reduzir a área sob a curva de parasitemia comparativamente às monoterapias, independente da linhagem de camundongo, sugerindo interação positiva entre os fármacos. Curiosamente, o ravuconazol em subdose reduziu drasticamente a parasitemia dos camundongos infectados pela cepa Colombiana enquanto a combinação não induziu benefício adicional. A avaliação histopatológica do tecido muscular cardíaco mostrou que a utilização combinada de ravuconazol e amiodarona, ao contrário das monoterapias nas mesmas doses, amenizou os danos provocados pela infecção, independente da cepa do parasito ou da linhagem do hospedeiro. Os dados obtidos permitem concluir que a estratégia experimental adotada foi eficiente para avaliar a interação entre os fármacos e sugerem que a linhagem BALB/c constitui um modelo mais estringente para estudos pré-clínicos na quimioterapia da doença de Chagas. Ainda, o ravuconazol e amiodarona combinados apresentam efeito superior às monoterapias em reduzir o parasitismo e prevenir as lesões cardíacas decorrentes da infecção.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Impacto da utilização de diferentes formas evolutivas de Trypanosoma cruzi no processo de screening de novos fármacos
    (Universidade Federal de Alfenas, 2021-02-26) Bonilha, Ana Letícia Caproni; Castro, Lívia De Figueiredo Diniz; Mazzeti, Ana Lia; Marques, Marcos José
    T. cruzi é um parasito que apresenta em seu ciclo de vida diferentes estágios evolutivos e todos podem ser empregados em screening de moléculas tripanossomicidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto da utilização das diferentes formas evolutivas de T. cruzi na determinação da atividade de produtos de origem natural e fármacos sintéticos. O estudo foi feito por meio de duas estratégias: revisão sistemática da literatura e avaliação experimental. A estratégia de busca foi feita de acordo com o PRISMA e incluiu a construção de filtros específicos para recuperação de artigos nas bases PubMed, Web of Science e Scopus. Foram extraídas de cada artigo informações sobre a cepa do parasito, protocolo experimental, fármaco(s) de referência e desfecho in vivo, quando aplicável. Foram incluídos na revisão 226 artigos completos. Os resultados mostraram um notável crescimento no número de publicações na última década, comparativamente aos outros períodos. Os resultados indicaram grande heterogeneidade relacionada à utilização de formas evolutivas, cepas do parasito e protocolos para determinação de atividade. Epimastigota foi a forma evolutiva mais frequentemente utilizada nos estudos envolvendo produtos naturais (75%), enquanto para substâncias sintéticas e semissintéticas a utilização das três formas foi similar. Foram identificadas alterações expressivas nos valores de EC-50 entre amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas, no entanto, devido à heterogeneidade dos protocolos experimentais utilizados não foi possível mensurar o impacto da utilização de uma ou outra forma no valor translacional do screening. Para a avaliação experimental, foram utilizados dois grupos de substâncias: (i) produtos de origem natural que apresentam ou não alguma evidência de atividade anti-T. cruzi já relatada (própolis vermelha, a geoprópolis e 11 extratos de fungos endofíticos isolados a partir da planta Dalbergia ecastaphyllus); (ii) fármacos que apresentam atividade anti-T. cruzi (nitroimidazólicos e azólicos). Após estudo de toxicidade em células Vero, concentrações não tóxicas dos produtos naturais foram utilizadas para o screening da atividade tripanossomicida sobre as diferentes formas evolutivas da cepa Y. Não foi detectada atividade anti-epimastigota para nenhum produto de origem natural e azólicos, enquanto para esses mesmos grupos de moléculas níveis máximos de 50% de mortalidade sobre tripomastigotas foram observados. Perfil diferente foi observado para as amastigotas, com percentuais de inibição que variaram de 60% a 90% para as própolis e extratos de fungos endofíticos. Foram avaliadas então curvas dose-efeito sobre amastigotas para três dos extratos de fungos, além das própolis, resultando em valores de EC-50 médios similares (aproximadamente 6 μg/mL), exceto para um dos extratos, cuja EC-50 foi de 9,76±0,89 μg/mL. Em relação às moléculas de referência do grupo dos nitroimidazólicos, o nível de atividade sobre as diferentes formas evolutivas foi similar. Os dados obtidos demonstraram que a forma evolutiva do parasito, pode influenciar no perfil de resposta do parasito ao tratamento. Devido à heterogeneidade de protocolos referidos na literatura, não foi possível inferir sobre o valor translacional dos modelos utilizados na quimioterapia experimental in vitro. Nesse sentido, a harmonização das estratégias experimentais é essencial para definir estratégias de screening viáveis, reprodutíveis e selecionar de maneira mais assertiva moléculas tripanossomicidas promissoras.