Mestrado em Ciências Biológicas

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Acesso aberto (Open Access)
Abordagem racional de imunoinformática para o desenvolvimento de candidatos vacinais multiepítopos do SARS-CoV-2 e Mpox vírus
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-02-28) Santos, Natália Cristina De Melo; Almeida, Leonardo Augusto De; Santos, Thaís Cristina Ferreira Dos; Veras, Flávio Protásio
As doenças emergentes e reemergentes simbolizam uma ameaça crescente à saúde global, influenciadas por fatores como globalização, mudanças climáticas e interações humanas com animais. A pandemia de COVID-19 é um exemplo recente que evidencia a ameaça crescente dessas doenças à saúde pública global, enfatizando a necessidade de estratégias eficazes para lidar com doenças zoonóticas, como o recente surto reemergente da varíola dos macacos. A vacinação é uma das abordagens mais eficazes para a proteção contra doenças infecciosas. No entanto, o desenvolvimento de vacinas é um procedimento complexo e demorado, mas que pode ser otimizado empregando a vacinologia reversa, que utiliza técnicas in silico para identificação e escolha de antígenos. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi desenvolver potenciais candidatos vacinais para a COVID-19 e a varíola dos macacos. O trabalho está estruturado em dois capítulos, com o primeiro abordando a construção de proteínas quiméricas utilizando epítopos do vírus SARS-CoV-2, e o segundo na construção de uma proteína quimérica com epítopos obtidos por meio de abordagem imunoinformática para o vírus Mpox. As proteínas obtidas demonstraram estabilidade, antigenicidade e ausência de potenciais riscos alergênicos. Além disso, por meio de simulações de acoplamento molecular, observou-se que essas proteínas são capazes de interagir com receptores do sistema imunológico, sendo que as simulações imunes indicaram a capacidade de desencadear respostas imunológicas significativas. Embora os resultados sejam promissores, são necessários testes adicionais in vitro e in vivo para consolidar e validar essas descobertas antes de avançar para ensaios clínicos em humanos. Dessa forma, esse trabalho contribui para a compreensão e potencial combate a doenças infecciosas emergentes e reemergentes, destacando a importância da vacinologia reversa como uma abordagem ágil e promissora no desenvolvimento de vacinas.
Acesso aberto (Open Access)
Análise as regiões uc.112, uc.122, uc.160 e uc.252 na Leucemia Linfóide Aguda
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-04-24) Chagas, Pablo Ferreira Das; Oliveira, Jaqueline Carvalho De; Brassesco, Maria Sol; Paranaíba, Lívia Máris Ribeiro
A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é uma neoplasia de células hematopoiéticas caracterizada pela proliferação e acúmulo de blastos comprometidos com a linhagem linfoide na medula óssea (MO). Apesar de todo avanço no tratamento, ainda 20 a 30% dos pacientes sofrem recaída e as causas dessa falha permanecem desconhecida. Recentemente, a análise de expressão de RNAs não codificadores (ncRNA) de proteínas tem se mostrado uma abordagem promissora e informativa, entre esses, ncRNA identificados em regiões ultraconservadas transcritas (T-UCRs). Em 2007, um trabalho precursor sobre o tema, identificou o perfil de expressão dos T-UCRs característico à Leucemia Linfóide Crônica (LLC) e aos carcinomas hepatocelular e colorretal. Posteriormente, a desregulação de alguns T-UCRs também foi descrita em neuroblastoma pediátrico, e em outros tumores, porém, na LLA não foi encontrado nenhum trabalho que analisa o perfil de expressão de qualquer T-UCR em amostras de MO tumoral. Visto a grande heterogeneidade molecular nessa doença e a necessidade do melhor entendimento das vias moleculares que possam estar envolvidas com a progressão da doença, o objetivo do presente trabalho foi analisar a expressão de alguns T-UCRs em 58 amostras de MO de crianças e adolescentes diagnosticados com LLA e buscar associações do nível de expressão a características biológicas e clínicas. Para isso, foi utilizado amostras de medula óssea de pacientes com LLA coletadas ao diagnóstico e realizado a análise de expressão gênica através da técnica de Polimerase Chain Reaction (PCR) em tempo real quantitativo (qRT-PCR) P<0,05, das regiões ultraconservadas uc.112; uc.122; uc.160; uc.252; uc.262 e uc.316. Os resultados apontaram uma hiperexpressão da região uc.112 em amostras de MO com LLA em relação as amostras de MO sem doenças hematológicas, como também em pacientes diagnosticados com Leucemia Linfoide Aguda de células T (LLA-T) com relação aos pacientes diagnosticados com Leucemia Linfoide Aguda de células B (LLA-B), apresentou também uma baixa expressão e pacientes com hiperdiploidia e está associada à alguns fatores de transcrição. A região uc.160 também obteve uma expressão aumentada em pacientes LLA-T com relação aos pacientes LLA-B e ainda sofre influências de alguns fatores de transcrição sendo estes: EZH2, SUZ12, MAX, CTFC, CHD2, ELF1, RUNX3, XY1, E2F6, RAD21, EBF1, SMC3, USF1. A região uc.262 encontrou-se hipoexpressa em amostras de MO com LLA em relação as amostras livre de doenças hematológicas. O presente trabalho contribui para sugestão de um possível envolvimento dos T-UCRs na LLA, porém, novas análises se fazem necessárias para confirmar e estender esses achados.
Acesso aberto (Open Access)
Análise da distribuição espacial da casuística de câncer oral no Sul de Minas Gerais
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-07-28) Rodrigues, Patrícia Araujo; Oliveira, Carine Ervolino De; Monteiro, Bárbara Vanessa De Brito; Andrade, Ana Luiza Dias Leite De
A forte influência de fatores socioeconômicos na etiologia do câncer oral (CO) é evidenciada pela elevada frequência de diagnósticos em estágios avançados em países em desenvolvimento. No entanto, são escassos os estudos acerca do impacto da exposição a agrotóxicos ou da influência de fatores socioeconômicos na incidência do CO no Brasil. O Brasil é um país de dimensões continentais, cujas diversas regiões geográficas apresentam diferentes condições demográficas, econômicas, culturais e de saúde, além de desigualdades internas generalizadas que, podem desempenhar um papel importante na carcinogênese oral. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar a distribuição espacial da casuística de CO no Sul de Minas Gerais explorando sua possível associação com porcentagem de estabelecimentos que admitiram usar agrotóxicos; a renda per capita; a porcentagem de analfabetismo e de indivíduos com idade ≥ 15 anos com segundo ciclo do fundamental completo; a expectativa de vida e a porcentagem de indivíduos com 60 anos ou mais, segundo o município de residência dos pacientes. Para isso, foi realizada uma análise retrospectiva de prontuários de pacientes com CO atendidos no Hospital Bom Pastor, localizado no município de Varginha-MG, no período de 2003 a 2013. Os resultados revelaram que dentre os 286 pacientes incluídos no estudo, houve um predomínio de homens, leucodermas, na sétima década de vida e tabagistas. Houve um aumento na incidência de CO no período analisado, sendo a língua e o assoalho bucal as localizações mais frequentes. Foi constatado um predomínio de pacientes com lesões em estágios avançados (III e IV), porém, as informações anatomopatológicas quanto ao comprometimento de margens, invasão vascular e perineural ou a ocorrência de metástases linfonodais estavam ausentes em um grande número de portuários. A análise da distribuição espacial revelou que os municípios de Pouso Alegre (n=24), Varginha (n=22), Lavras (n=22) e Itajubá (n=18) apresentaram as maiores concentrações de pacientes com CO. Com exceção de Itajubá, os municípios nos quais residiam os pacientes com CO apresentaram alta porcentagem de estabelecimentos que admitiram usar agrotóxicos. Pouso Alegre, Varginha, Lavras e Itajubá foram as exceções dentre os 74 municípios onde residiam os pacientes com CEC oral pois, apresentaram elevada renda per capita, baixa porcentagem de analfabetos e de indivíduos que não completaram o segundo ciclo do fundamental. Uma elevada expectativa de vida e reduzida proporção de indivíduos idosos (60 anos ou mais) foi observada nos municípios em que residiam a maioria dos pacientes com CO, ressaltando a necessidade de educação e planejamento georreferenciado dos recursos em saúde como medida preventiva ao aumento da incidência da doença com o envelhecimento da população desta região.
Acesso aberto (Open Access)
Análise da localização, da expressão gênica e predição estrutural de adesinas hipotéticas no patógeno emergente Trichosporon asahii
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-02-28) Lima, Alexandre Anderson De; Padovan, Ana Carolina Barbosa; Gouveia, Viviane Alves; Dias, Amanda Latércia Tranches
O gênero Trichosporon spp. pertence ao filo Basidiomycota e atualmente conta com 12 espécies, sendo Trichosporon asahii a que possui maior relevância clínica, causando infecções invasivas que alcançam uma taxa de mortalidade de até 80%, o que depende do estado imunológico do paciente, da capacidade do fungo em crescer em diferentes morfologias e da susceptibilidade limitada aos antifúngicos, bem como, de sua capacidade de formar biofilmes. A formação de biofilmes depende da síntese de adesinas que medeiam as interações célula-meio nas diferentes morfologias do fungo. Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram verificar se proteínas com função preditiva de adesinas são expressas em leveduras e hifas de T. asahii e se são encontradas na superfície celular deste fungo, bem como analisar os modelos tridimensionais dessas adesinas. Para isso, camundongos isogênicos 129/Sv foram inoculados com extrato de proteínas totais de leveduras e de hifas para geração de antissoros policlonais que foram avaliados por ensaio imunoenzimático (ELISA), mostrando que houve diferença na quantidade de anticorpos gerados contra as proteínas totais de leveduras e hifas e que os mesmos reconheceram diferencialmente os extratos proteicos opostos aos quais foram produzidos de forma significativa (p<0,05), e que os anticorpos gerados contra proteínas de hifas possuem maior força de ligação. Os antissoros policlonais foram utilizados em ensaios de microscopia de imunofluorescência, ambos contra leveduras e contra hifas, mostrando reconhecimento das diferentes morfologias de forma semelhante e independente das células terem passado por tratamento de permeabilização ou não. Além disso, quatro proteínas previamente caracterizadas in silico por nosso grupo como potenciais adesinas (Restina-like, CFL1-like, Mar-like e Beta-like) tiveram sua estrutura proteica terciária modelada no servidor I-TASSER. A partir de cinco modelos gerados para cada adesina foi escolhido aquele que apresentou o maior valor de confiança (C-score). Em seguida, as sequências de aminoácidos das proteínas foram analisadas no programa TepiTool no NetMHCII para identificar peptídeos reconhecidos por alelos do MHC classe II humanos e H2 murino. Os peptídeos foram então, analisados no programa VaxiJen v. 2.0 para verificar a imunogenicidade dos mesmos, com ponto de corte > 0,5. Em seguida, os peptídeos de cada proteína foram localizados na estrutura 3D de cada proteína no programa PyMol 3.1. Finalmente, foram selecionados aqueles que se encontraram na superfície de cada modelo proteico e próximos à região N-terminal. Estes peptídeos foram sintetizados por empresa comercial e inoculados em camundongos para produção de antissoro específico contra cada peptídeo. Através dos anticorpos policlonais gerados contra cada peptídeo, proteínas de superfície foram detectadas na superfície de leveduras e de hifas de T. asahii. O ensaio piloto de reconhecimento de proteínas por Western blot não trouxe conclusões definitivas a repeito da eficácia do reconhecimento das adesinas pelos anticorpos gerados contra os peptídeos. A análise de expressão gênica das quatro potenciais adesinas em leveduras e hifas mostrou que todas são sintetizadas em maior grau nas hifas de T. asahii. A partir das estruturas 3D das quatro adesinas foi realizado ensaio in silico de docking molecular, mostrando que todas as quatro adesinas se ligam a proteínas humanas que são alvo da adesão celular de patógenos. Este trabalho contribuiu para a compreensão da interação molecular entre o patógeno emergente T. asahii e os tecidos de seu hospedeiro humano.
Embargo
Análise da transferência celular adotiva de macrófagos estimulados com BCG no controle do câncer de mama triplo-negativo em modelo murino
(2025-02-21) Santos, Joyce Alves dos; Almeida, Patricia Paiva Corsetti de; Santos, Thaís Cristina Ferreira dos; Rabelo, Ana Carolina Silveira
O câncer de mama é uma das principais causas de morte entre mulheres no Brasil e no mundo. Entre seus subtipos, o câncer de mama triplo-negativo (TNBC) tem o pior prognóstico, por ser o mais agressivo e não apresentar três principais receptores (estrogênio, progesterona e HER2) que são os alvos de terapias específicas para o câncer de mama. No microambiente tumoral, há infiltração de células imunes, principalmente macrófagos que desempenham papéis importantes no combate tumoral. Os macrófagos podem ser induzidos a um estado anti-inflamatório pró tumoral (M2), enquanto um fenótipo pró-inflamatório (M1) seria mais importante para o controle do tumor. A BCG (Bacilo Calmette-Guérin) é a única vacina que protege contra tuberculose em humanos e vem sendo estudada no tratamento de alguns tipos de cânceres. O objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito do BCG na estimulação de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) bem como o efeito in vivo utilizando BMDMs estimulados pelo BCG (BMDM+BCG) no tratamento do câncer de mama triplo negativo (células 4T1). Para isso, BMDMs derivados de camundongos fêmeas da linhagem BALB/c, foram estimulados com BCG ou seus controles e seus sobrenadantes foram coletados para análises de consumo de glicose, produção de lactato, NO e citocinas IL-10 e TNF-α. Ensaio de migração celular foi realizado para análise do efeito do meio condicionado sob as células 4T1. O estímulo com BCG em BMDMs levou ao aumento do consumo de glicose, produção de lactato, óxido nítrico e TNF-α além de impedir parcialmente a migração de células tumorais 4T1. Após análises, os BMDMs estimulados com BCG ou seus controles foram utilizados como tratamento do câncer de mama triplo negativo pela transferência celular adotiva in vivo. Foi realizada a indução do tumor de mama triplo negativo (células 4T1) em camundongos BALB/c e no dia 11 os animais foram tratados em dose única com injeção subcutânea no mesmo local da indução do tumor com: PBS, BMDMs+BCG, apenas BMDMs, BCG ou quimioterápico 5FU (5 Fluorouracil). O tratamento com BMDM+BCG diminuiu a perda de peso, melhorou o consumo de ração dos animais e diminuiu o volume tumoral. Além disso, a análise histopatológica da pele mamária, demonstrou que o tratamento BMDM+BCG levou a redução significativa no acúmulo de células tumorais, semelhante ao encontrado no grupo 5FU, porém, apresentou maior infiltração inflamatória no fígado e pulmão, caracterizando uma resposta inflamatória mais robusta, que apesar de ser eficaz no combate as células cancerosas, pode gerar maior dano tecidual e comprometimento funcional dos órgãos. O tratamento apenas com BCG apresentou menor eficácia na diminuição do volume tumoral em relação ao tratamento com BMDM+BCG e demonstrou menor infiltração inflamatória nos tecidos. É possível concluir que o tratamento com BMDM estimulado com BCG apresenta eficácia no combate ao crescimento tumoral. Contudo, a resposta inflamatória robusta pode prejudicar a integridade dos órgãos, sendo necessários mais estudos para avaliar o tratamento a longo prazo, além de estratégias no controle da resposta inflamatória. Esta abordagem abre caminhos para terapias futuras contra o câncer de mama triplo negativo.
Acesso aberto (Open Access)
Análise de expressão dos genes SAP9 e SAP10, de aspectos bioquímico e ultraestrutural em linhagem padrão de Candida albicans, em estado planctônico e biofilme, antes e após a associação de Fluconazol e Guttiferona A
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-04-25) Lima, Camila Miranda Pernambuco De; Dias, Amanda Latercia Tranches; Loyola, Ana Beatriz Alkimim Teixeira; Coelho, Luiz Felipe Leomil
Introdução: Dentre as espécies de fungos causadoras de infecções na corrente sanguínea, Candida albicans é a prevalente. A compreensão dos fatores associados à virulência deste fungo, dentre eles, a expressão das isoenzimas Aspartato Proteases Secretadas (Sapp) e a formação de biofilmes, são de grande relevância na tentativa de se encontrar possíveis alvos terapêuticos. Objetivos: Avaliar os tipos de interação entre Fluconazol e Guttiferona A, em estado planctônico e biofilmes, por meio de análise morfotopográfica e da expressão gênica de SAP9 e SAP10, afim de verificar possíveis mecanismos de ação do composto Guttiferona A em C. albicans. Metodologia: Avaliamos a expressão gênica de SAP9 e SAP10, quantificamos o ergosterol produzido nas células sob tratamento e avaliamos por meio de microscopia de força atômica (AFM) características ultraestruturais em células planctônicas e biofilmes de Candida albicans, antes e após tratamento isolado e associado entre fluconazol (FLC) e Guttiferona A (GUT). Resultado: A linhagem SC5314, em estado planctônico, foi sensível ao FLC (0,125 μg/mL) e a GUT (7,5 μg/mL). As associações apesentaram efeito sinérgico com inibição de 75% do crescimento, de C. albicans (FICI=0,156). As células sob associação apresentaram alterações morfológicas, como aumento de tamanho (p<0,001), redução na produção do ergosterol (p<0,001), e redução na expressão de SAP9 e SAP10 em células planctônicas, quando comparadas ao controle. Nos biofilmes, o fungo apresentou resistência de mais de 2000 vezes quando tratado com as substâncias isoladamente e não houve atividade nas associações. GUT 1024 μg/mL promoveu um aumento na biomassa dos biofilmes (p<0,001) e, sob tratamentos com 16 μg/mL deste composto, as células apresentaram um aumento de tamanho em relação ao controle (p<0,001). Conclusão: A associação de GUT ao FLC apresenta potencial farmacológico contra C. albicans, promovendo uma atividade sinérgica com alterações significativas na estrutura deste fungo.
Acesso aberto (Open Access)
Análise diferencial da capacidade de formação de biofilmes e sensibilidade antifúngica de Candida albicans e espécies não-albicans de Candida isoladas de pacientes criticamente enfermos sujeitos a eventos adversos relacionados à assistência
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-09-23) Reis, André Francisco Dos; Dias, Amanda Latercia Tranches; Lucas, Rosymar Coutinho De; Oliver, Josidel Conceição
Objetivo. Este estudo objetiva a análise diferencial da capacidade de formação de biofilmes e da sensibilidade antifúngica de células planctônicas e biofilmes de Candida albicans e Candida spp. não- albicans isoladas de pacientes criticamente enfermos, sujeitos a eventos adversos relacionados à assistência. Metodologia. Foram avaliadas amostras de Candida spp. isoladas de secreção traqueal, urina, corrente sanguínea e outros sítios de pacientes, maiores de 18 anos, dos setores de Terapia Intensiva e Emergências da Irmandade do Hospital da Santa Casa de Poços de Caldas, sujeitos a incidentes que possam estar relacionados ao estabelecimento de infecção fúngica. Os isolados foram identificados por espectrometria de massa MALDI-TOF e avaliados quanto à sensibilidade das células planctônicas e dos biofilmes aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e itraconazol. Os prontuários destes pacientes foram examinados a partir da data da 1ª internação até o momento de desfecho clínico, com alta ou óbito do paciente. A identidade dos pacientes e as informações contidas nos prontuários foram preservadas conforme Resolução CNS nº 466/2012. Os critérios de rastreamento adotados para a análise dos prontuários fizeram referência à assistência à saúde, à terapia intensiva e à prescrição de medicamentos. Resultados: Foram analisados os prontuários e as amostras de 43 pacientes. O tempo de internação variou de 1 a 127 dias e todos os pacientes foram submetidos, durante o período de sua internação, a um ou mais eventos adversos relacionados à assistência, tais como utilização de ventilação mecânica, cateter venoso central, cateter venoso periférico, sonda vesical de demora, utilização de substâncias vasoativas, dentre outros. Os 43 pacientes apresentaram positividade para cultura fúngica, sendo este um dos principais critérios para a seleção do paciente integrante desta pesquisa. Ressalta-se que do total de 43 amostras, 23 foram fenotipicamente identificadas como pertencentes à espécie C. albicans, e 20 como Candida ssp. não-albicans. Deste total, 33 amostras puderam ser identificadas por MALDI-TOF (51,5% C. albicans e 48,5% Candida spp. não albicans) e apresentaram a capacidade de formação de biofilmes, sendo que 30% dos isolados apresentaram biofilmes com elevado potencial metabólico. Quanto à sensibilidade antifúngica, observou-se uma relação direta com a sensibilidade à Anfotericina B e situações de baixa sensibilidade aos fármacos Itraconazol e Fluconazol, inclusive com situações de resistência. Conclusão: A relevância desta pesquisa assenta-se solidamente na necessidade cada vez maior de centros de saúde, tais como os hospitais, que lidam com pacientes criticamente enfermos, conhecerem obrigatoriamente sua comunidade fúngica e seus perfis de sensibilidade aos antifúngicos; bem como o percentual de formação de biofilmes que podem influenciar negativamente na capacidade de resolução dos processos infecciosos,na ação dos antifúngicos então utilizados, e sua correlação com o eventual e inevitável evento adverso relacionado à assistência.
Acesso aberto (Open Access)
Análise do efeito adjuvante de nanopartículas de albumina sérica bovina na imunização de camundongos utilizando a proteína não estrutural 1 do Dengue vírus
(Universidade Federal de Alfenas, 2016-12-08) Silva, Natalia Ingrid Oliveira Da; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Marques, Marcos José; Drumond, Betânia Paiva
A dengue é uma doença viral, sistêmica, considerada endêmica em mais de 128 países, com cerca de 3,9 bilhões de pessoas no mundo vivendo em áreas de risco de infecção. O vírus da dengue é transmitido para humanos através da picada de mosquitos fêmeas do gênero Aedes infectadas. DENV é um vírus de RNA com polaridade positiva pertencente á família Flaviviridae, gênero Flavivirus. O desenvolvimento de uma vacina que confira imunidade de forma segura e eficiente, contra os quatro sorotipos do DENV é considerado prioritário. A proteína NS1, conservada entre sorotipos do DENV (1-4), está relacionada a processos imunopatológicos observados nas formas mais graves da dengue, sendo responsável pela indução da produção de citocinas inflamatórias e aumento da permeabilidade endotelial via ativação de receptores do tipo Toll 4. Pesquisas sugerem o uso da NS1 como candidato vacinal contra dengue, uma vez que a vacinação com NS1 recombinante foi capaz de proteger camundongos contra doses letais de sorotipos homólogos e heterólogos do DENV. Estudos preliminares do nosso grupo mostram que nanopartículas de albumina sérica bovina (NPBSA) são promissores sistemas vacinais de entrega de antígenos do DENV e outros antígenos microbianos, pois possuem, provavelmente, uma atividade adjuvante. Assim, este estudo teve como objetivo verificar o potencial adjuvante das NPBSA em induzir a produção de anticorpos anti-NS1 em camundongos. Os resultados obtidos indicam que as NPBSA não apresentaram citotoxicidade significativa em culturas de células macrofágicas RAW 264.7 e células fibroblásticas BHK-21, porém, as NPS foram capturadas mais facilmente pelas células RAW 264.7 do que por células BHK-21. A NS1 do DENV-1 foi expressa em sistema procarioto e depois utilizada como antígeno. A administração subcutânea das NPs em camundongos na presença ou ausência da proteína NS1 foi capaz de induzir o recrutamento de um infiltrado inflamatório nos locais onde a mesma foi aplicada. Após a imunização, foi observado que as NPBSA foram capazes de induzir a produção de anticorpos IgM anti-NS1 em 60% dos animais imunizados e IgG anti-NS1 em 80%. Estes dados podem estar relacionados com o perfil adjuvante das NPs, que ao serem administradas associados a NS1, foram capazes de induzir uma troca de classe mais rápida, levando à produção de plasmócitos secretores de IgG. Estudos futuros serão realizados para verificar se os anticorpos produzidos são capazes de inibir a ligação da NS1 ao receptor Toll 4 e diminuir assim, a produção de citocinas pró-inflamatórias responsáveis pelo aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de plasma.
Acesso aberto (Open Access)
Atividade alelopática de extratos foliares de malpighia glabra l. em bioteste com lactuca sativa L.
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-08-04) Vieira, Guilherme Sérgio; Barbosa, Sandro; Rodrigues, Luiz Carlos De Almeida; Silva, Marcelo Aparecido
A alelopatia é um processo derivado do metabolismo secundário das plantas, onde o vegetal libera substâncias químicas, que podem apresentar mecanismos de ação direta ou indireta no desenvolvimento de outras plantas, resultando em um efeito inibitório ou uma ação estimuladora. A espécie Malpighia glabra L., conhecida popularmente como acerola, possui amplo consumo no Brasil, com grande potencial econômico e nutricional, devido ao seu alto teor de vitamina C. As folhas apresentam cumarinas, flavonoides, ácidos fenólicos e aminoácidos (asparagina, prolina, alanina e metionina). A presença destes constituintes químicos torna a acerola numa espécie com potencial alelopático. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade alelopática de extratos foliares de M. glabra em bioteste com Lactuca sativa L. Onde obtemos extratos secos, aquoso e hidroetanólico, para a realização de estudos dos efeitos fitotóxico e citogenotóxico na germinação e crescimento inicial de L. sativa. As soluções testes foram preparadas nas concentrações de 5, 10, 20 e 40 mg.mL-1 , utilizou-se como grupo controle a água destilada. Os parâmetros avaliados foram: a porcentagem de germinação inicial e final, o índice de velocidade de germinação, o índice de efeito alelopático, o comprimento de parte aérea, o alongamento de raiz, o índice mitótico e a frequência de anormalidades cromossômicas. Os resultados mostraram que os extratos em concentrações mais altas causaram anormalidades na divisão celular e reduziram o desempenho germinativo das sementes de alface. As anormalidades incluíram micronúcleos, pontes em anáfase e telófase, c-metáfases, stickiness, cromossomos perdidos e cromossomo atrasado em anáfase e telófase. Além disso, os extratos também causaram alterações na atividade enzimática das sementes de alface. Isso sugere que o uso desses extratos pode ter efeitos negativos sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da associação de um peptídeo imunogênico da proteína apolipoproteína n-acetiltransferase de Brucella abortus com nanopartículas de ouro sobre macrófagos : Efeito adjuvante de nanopartículas de ouro com peptídeo de Brucella abortus em macrófagos
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-08-02) Andrade, Alex Junior De; Almeida, Leonardo Augusto De; Macedo, Gilson Costa; Silva, Evandro Neves
As bactérias do gênero Brucella, um cocobacilo gram-negativo, são classificadas com base em seus hospedeiros primários, tendo a Brucella abortus como a mais distribuída globalmente e afetando principalmente a população de bovinos, causando aborto e infertilidade. Atualmente a forma de controle dessa doença é a vacinação dos animais, porém as vacinas que são comercializadas utilizam cepas atenuadas, e apesar de imunogênicas, apresentam várias desvantagens, como a prevalência de testes soropositivos em bovinos, ocorrendo incidência de virulência e contaminação acidental. Devido a isso, as vacinas de subunidades são abordagens promissoras, seguras, eficazes e com menor custo para produção. Nessa perspectiva, o presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a conjugação do peptídeo imunogênico "AIPYILESTPQALAH" de B. abortus cepa 2308 com AuNPs e caracterizar essa associação sobre macrófagos. As AuNPs foram sintetizadas, seguidas de imobilização com o 11-ácido mercaptoundecanóico (MUA) e funcionalização com a reação química de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)/Nhidroxisuccinamida (NHS). Cada etapa da síntese foi avaliada e os componentes caracterizados por FTIR, MEV-FEG, UV/VIS e DLS. Os dados indicam sucesso na associação com AuNPs@MUA e o peptídeo. A fim de entender a influência do bioconjugado, macrófagos derivados da medula óssea murina (BMDM) foram obtidos e tratados. Pelo teste de MTT foi observada uma diminuição de viabilidade celular em torno de 40%, nas amostras com AuNPs independente da bioconjugação, mostrando certo grau de toxicidade das AuNPs. Entretanto, as AuNPs foram capazes de promover um aumento de atividade metabólica dos macrófagos, havendo consumo de glicose e maior produção de lactato, houve também uma secreção de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α, seguido de produção de óxido nítrico, indicando que a nanopartícula já é capaz de gerar um efeito adjuvante, enquanto que o bioconjugado apresentou as mesmas respostas, mas de maneira menos elevadas, indicando uma boa biocompatibilidade. Os resultados indicam um promissor bioconjugado para ser avaliado em modelos pré-clínicos para futuramente uma maior abrangência do potencial terapêutico e imunológico deste candidato vacinal.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da atividade anti-inflamatória e antifúngica in vitro e ex vivo da própolis verde brasileira frente a fungos do gênero Paracoccidioides spp.
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-02-21) Dutra, Julia De Castro; Burger, Eva; Burger, Eva; Santos, Hadassa Cristhina De Azevedo Soares Dos; Dias, Amanda Latércia Tranches
A paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica, granulomatosa, é ocasionada por fungos do gênero Paracoccidioides spp., com duas espécies patogênicas, Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) e Paracoccidioides lutzii (Pl), as quais são termicamente dimórficas variando em forma micelial e leveduriforme. A PCM demonstra em seus portadores graves consequências clínicas que requerem opções terapêuticas mais ampliadas, visto que, há números reduzidos de medicamentos e os disponíveis possuem tempo prolongado de tratamento, sendo assim, busca-se um tratamento complementar como uma forma de imunomodular o sistema imunológico. Sabe-se que pacientes com PCM possuem uma resposta imune deficiente frente a microrganismos patogênicos invasores, por este motivo, é proposto uma associação da Própolis Verde Brasileira (PVB), cujo intuito é modular o sistema imune. A própolis vem sendo mencionada na literatura devido suas atividades anti-inflamatórias, antimicrobianas e imunomoduladoras. Objetivo: estudar as propriedades anti-inflamatórias e antifúngicas do extrato da PVB frente ao curso geral da PCM, buscando encontrar uma redução dos níveis de infecção e uma resposta anti-Pb18 e Pl. Metodologia: Inicialmente foram realizados estudos in vitro. O teste de atividade antimicrobiana foi realizado sobre as cepas Pb18 e Pl para avaliar se a PVB apresentou atividade microbicida na concentração de 500 mg/mL. Posteriormente, células esplênicas de baço de camundongos Swiss foram utilizadas para avaliar a citotoxicidade da PVB, na concentração de 500 mg/mL. Em seguida, foram realizados os experimentos ex vivo utilizando a técnica de infecção subcutânea “air-pouch”. Os animais foram infectados com suspensões fúngicas (Pb18 e Pl) a partir da técnica de “air pouch”, espécie de uma bolsa de ar subcutânea, por 10 dias. O tratamento com o extrato de PVB foi realizado nos últimos três dias de infecção. No final do processo as células foram coletadas a partir da bolsa de ar e separadas em sedimento e sobrenadante para a realização dos seguintes testes: quantificação de óxido nítrico, proteínas totais, enzima catalase, peroxidase, dosagem de citocinas, viabilidade celular, quantificação de células e fungos viáveis e atividade fagocítica de PMNs. Resultados: Em resultados in vitro a PVB apresentou atividade antimicrobiana sobre as duas cepas. Na cultura de células esplênicas a concentração de PVB testada não apresentou toxicidade. Ao avaliar se a PVB melhora a capacidade de esplenócitos para a eliminação do fungo, independente da cepa, os resultados do teste com a PVB mostraram-se significativos em relação ao controle. O tratamento em animais aumentou a viabilidade das células imunes, proteínas totais, catalase, peroxidase e produção das citocinas INF-y e IL-12. O tratamento com a PVB também foi capaz de reduzir o número de fungos viáveis, quando comparados aos grupos controle (Pb18 e Pl), além de demonstrar uma maior atividade fagocítica de PMNs. Conclusão: A PVB foi capaz de imunomodular o sistema imune, uma vez que, na população tratada houve maiores níveis de atividade de PMNs, além disso, reduziu o número de fungos viáveis e estimulou a produção de proteínas totais e citocinas ligadas a resposta do tipo Th1. Nesse sentido, a aplicação do extrato da PVB pode ser um fator promissor ao longo do tratamento e desfecho da micose.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da atividade antimicrobiana e da toxicidade do Phtalox® em modelos in vitro e in vivo de Galleria mellonella
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-07-28) Bruzadelli, Rafaela Franco Dias; Ikegaki, Masaharu; Murata, Ramiro Mendonça; Almeida, Patricia Paiva Corsetti De
A doença periodontal é uma condição em que ocorre a deterioração progressiva dos tecidos moles e duros que compõem o complexo periodontal. Essa deterioração é resultado de uma interação complexa entre comunidades microbianas disbióticas e respostas imunológicas exacerbadas nos tecidos gengivais e periodontais. No contexto dessa doença, o biofilme periodontopatogênico é uma comunidade de microrganismos composta por diversas gêneros e espécies bacterianos, como a Porphyromonas gingivalis e a Tannerella forsythia. O tratamento para a doença periodontal muitas vezes envolve o uso de antibióticos, e, portanto, há uma necessidade de pesquisas voltadas para o desenvolvimento de novos antibióticos capazes de inibir ou eliminar o biofilme presente. Nesse contexto, o Phtalox ® (PHT) surge como um potencial antimicrobiano. Trata-se de uma ferro-ftalocianina modificada com grupos carboxila em suas extremidades e ferro no centro, que exibe propriedades oxidantes, promovendo a geração contínua de oxigênio reativo na presença de oxigênio molecular. Neste estudo, foi realizado o teste de determinação da concentração inibitória mínima (CIM) utilizando bactérias sésseis. Adicionalmente, foi cultivado e tratado um biofilme subgengival de sete dias composto por 33 espécies bacterianas. A atividade metabólica e a composição microbiana do biofilme foram avaliadas por meio da técnica de hibridização DNA-DNA, conhecida como técnica Checkerboard. Para o teste de toxicidade e de atividade antimicrobiana in vivo foi utilizado o modelo de Galleria mellonella, pois é um método reconhecido pela Rede Nacional de Métodos Alternativos ao Uso de Animais (RENAMA), onde as larvas possuem resposta imune celular mediada por células fagocíticas que podem ser comparadas aos neutrófilos dos mamíferos. Os resultados obtidos no teste de CIM indicaram que o PHT não apresentou inibição frente aos microrganismos testados e nas condições do método. No entanto, o PHT na concentração de 10.000 μM demonstrou eficácia estatisticamente semelhante à Clorexidina 2.374 μM (CLX) na redução do biofilme multiespécie subgengival in vitro, inibindo o crescimento de patógenos-chave da doença. Os testes de toxicidade in vivo utilizando o modelo de G. mellonella demonstraram que o produto não é tóxico, mesmo em altas dosagens. Além disso, o PHT se mostrou tão eficaz quando a CLX para a sobrevivência das larvas infectadas com Staphylococcus aureus. Esses resultados destacam o potencial do Phtalox ® como uma alternativa promissora no combate à doença periodontal.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da atividade leishmanicida de compostos orgânicos contendo prata em sua estrutura
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-07-25) Espuri, Patrícia Ferreira; Marques, Marcos José; Almeida, Letícia De; Caldas, Ivo Santana
As leishmanioses são um conjunto de doenças cuja maioria tem caráter zoonótico e são causadas por protozoários parasitos do gênero Leishmania, além de ameaçarem cerca de 350 milhões de indivíduos em 98 países. O tratamento é feito à base de antimoniais pentavalentes desde a década de 40, anfotericina B e pentamidina, porém a toxicidade destes, a persistência dos efeitos colaterais e a duração do tratamento são as principais dificuldades na terapia dos pacientes que apresentam tal doença. Neste contexto, a busca de novos fármacos menos tóxicos e mais eficazes é de extrema importância. Como há relatos na literatura de que a associação compostos de prata e ligantes diimínicos apresenta atividade leishmanicida, o presente estudo avaliou a atividade anti-Leishmania in vitro e in vivo de compostos orgânicos contendo este metal em sua estrutura (JB3, JB4, JB5, JB5SF e JB6), além dos ligantes 2-tionaimidazolina e fenantrolina e os prováveis mecanismos de ação. Para tanto, foram feitas análises das atividades leishmanicidas em promastigotas e amastigotas, no contexto in vitro, para a determinação do IC50, além da citotoxicidade em macrófagos peritoneais murinos para determinação do CC50. Para avaliar os possíveis mecanismos de ação destes compostos, foram feitos ensaios de inibição enzimática, utilizando isoforma r-CPB2.8; eletroforese para avaliar degradação do DNA; microscopia de força atômica e dosagem de óxido nítrico. Para análise in vivo foi utilizado PCR em tempo real para quantificar a carga parasitária de hamsters infectados com L. (L.) infantum chagasi após tratamento experimental. O composto que apresentou melhores resultados sobre atividade anti-promastigota e anti-amastigota de L. (L.) amazonensis (8,06 μg/mL, 1,30 μg/mL, respectivamente) e L. (L.) infantum chagasi (1,46 μg/mL, 8,21 μg/mL, respectivamente) foi o JB5, e o que apresentou menor toxicidade foi o 2-tionaimidazolina. Como alguns compostos apresentaram uma toxicidade considerável, avaliou-se este parâmetro no ligante fenantrolina e obteve-se CC50 = 30,80 μg/mL, concluindo que este contribui consideravelmente para a toxicidade dos compostos. Com isso, avaliou-se a atividade leishmanicida contra as formas do parasito do JB5SF (sem o grupamento fenantrolina) e obteve-se IC50 de 1,80 e 8,91 μg/mL. Apesar do 2-tionaimidazolina ter sido o de menor toxicidade não foi tão eficiente para reduzir a carga parasitária das amastigotas teciduais quanto o Glucantime. Contudo, o composto JB5SF que apresentou o maior índice de seletividade (40,34) foi capaz de reduzir a carga parasitária das amastigotas teciduais, apresentando estatística semelhante, no fígado comparado com o fármaco de referência. Os compostos não apresentaram atividade inibitória significativa frente à cisteíno proteases (rCPB2.8) e nem degradação do DNA do parasito. Especificamente o JB5SF na concentração de 5,0 μg/mL não produziu modificações na membrana do protozoário e não alterou significativamente a área da superfície do macrófago infectado. Todavia, o JB5SF na concentração de 10,0 μg/mL e associado ao LPS levou o macrófago infectado a uma maior produção de NO quando comparado ao não tratado. Embora não tenha sido definido o mecanismo de ação do composto sobre o parasito pode-se inferir que o mesmo pode contribuir com a resposta imune estimulando as células macrofágicas no processo de fagocitose.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da atividade leishmanicida no contexto in vivode compostos análogos da miltefosina
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-07-17) Silva, Joana Carolina Da; Marques, Marcos José; Laurenti, Márcia Dalastra; Castro, Lívia De Figueiredo Diniz
O tratamento quimioterápico de referência no Brasil para as leishmanioses são os antimoniais pentavalentes, que estão em uso a mais de 40 anos, e já não são mais eficazes o bastante para controlar a Leishmaniose Visceral (LV) em todo mundo. O uso de medicamentos de segunda escolha, tais como Anfotericina B, Pentamidina e Miltefosina têm sido estratégicos no tratamento da LV. Neste contexto, a síntese de novos compostos por meio de bioisosterismo tem sido aplicada. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico dos compostos Alquiltriazol (Composto C11) e Alquilfosfocolínico (Composto C4) ambos análogos da Miltefosina, em hamsters dourados (Mesocricetus auratus) infectados com L. (L.) infantum chagasi. Os animais foram infectados por via intraperitoneal com 1x107 amastigotas e após 60 dias de infecção foram tratados por 10 dias com 25mg/kg de C11 e C4 por gavagem e 50mg/kg de Glucantime (GLU) por via intraperitoneal. Ao fim do tratamento os animais foram eutanasiados e prosseguido da coleta de fígado e baço para carga parasitária por qPCR; análises histopatológicas e expressão de citocinas IL-10, IL-4, IL-17, TNF-α, TGF-β, INF-Υ por RTqPCR no baço. Os animais tratados com C11 e C4 não apresentaram uma redução significativa da carga parasitária quando comparados com o grupo infectado e não tratado (INT) (p>0,05). Mas foi possível observar que não houve uma diferença significativa entre a carga parasitária do fígado dos animais tratados com C11 e GLU (p>0.05). Histologicamente os animais tratados com C11 apresentaram uma maior preservação da relação de Polpa Branca (PB) e Polpa vermelha (PV), mantendo mais de 50% da polpa branca comparada a 9% do grupo INT, em relação ao saudável. A análise de expressão gênica da citocinas mostrou uma relação de resposta imunológica dos animais tratados com C11, onde observamos um aumento da expressão de IL-17 e TNF-α e redução da expressão de IL-10 comparados com INT (p<0,05). Estes dados indicam que o C11 pode ser um promissor composto a ser usado no tratamento da LV, uma vez que apresentou alguns resultados positivos contra a doença no modelo experimental em hamster.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da citotoxicidade do nifur0mox, fexinidazol-sulfona, amiodarona e alopurinol frente à infecção por Trypanosoma cruzi
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-02-28) Pereira, Gabriella Martiniano; Diniz, Lívia De Figueiredo; Reimão, Juliana Quero; Corsetti, Patrícia Paiva
Estudos sobre a quimioterapia anti-Trypanosoma cruzi avançaram muito nos últimos anos, culminando com a avaliação de candidatos a fármacos em estudos clínicos de fase II para o tratamento da doença de Chagas crônica. Porém, devido às limitações relacionadas à eficácia ou tolerabilidade dos candidatos, ainda não há tratamento satisfatório para a fase crônica da infecção. Os resultados obtidos com o fexinidazol, um dos candidatos mais promissores, são particularmente intrigantes; trata-se de um nitroimidazol que apresentou alta eficácia tripanossomicida e tolerabilidade em estudos pré-clínicos e clínicos de fase I, mas ao ser administrado a pacientes com a doença de Chagas induziu neutropenia e hepatotoxicidade relevantes. Muito embora estejam sendo amplamente discutidos os fatores envolvidos nas falhas terapêuticas observadas, os estudos e informações disponíveis na literatura sobre os efeitos tóxicos dos fármacos tripanossomicidas, mesmo aqueles de uso clínico, são escassos. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi investigar o perfil de citotoxicidade de fármacos com atividade tripanossomicida utilizando diferentes tipos celulares e tempos de incubação, na ausência ou presença da infecção por T.cruzi. Para tanto, foram escolhidos candidatos já avaliados em estudos não clínicos e clínicos – o fexinidazol-sulfona (metabólito ativo do fexinidazol), a amiodarona e o alopurinol, além do nifurtimox, que é um dos medicamentos de referência no tratamento da doença de Chagas. Células H9c2 e HepG2 foram incubadas ou não com os fármacos por dois períodos distintos, 72 e 120 horas, na ausência e presença da infecção pela cepa Y de T. cruzi. A viabilidade das células hospedeiras foi aferida por meio da redução de resazurina, comparativamente às células não infectadas e não tratadas. Foram realizados ainda, para fexinidazol-sulfona, ensaios de viabilidade com Sulforodamina B e avaliação da proliferação em esquema prolongado de tratamento (192 horas) por meio da determinação da CPD (cumulative population doubling). Os resultados dos ensaios com resazurina mostraram que o perfil de toxicidade foi variável para o tipo celular e fármaco, sugerindo relação com os mecanismos de ação e fisiologia das células. O fexinidazol-sulfona apresentou níveis baixos de interferência na viabilidade de ambas as células, com redução significativa da viabilidade celular a partir de 1mM. A amiodarona apresentou efeito tóxico concentração e tempo-dependente, com valores de CC-50 de 15µM a 41 µM. Já o nifurtimox induziu maior toxicidade em H9c2, enquanto o alopurinol foi significativamente mais tóxico para HepG2. A infecção pelo parasito não exerceu influência expressiva no perfil de viabilidade das células tratadas, provavelmente pela atividade anti- T. cruzi dos fármacos nas concentrações avaliadas. A determinação da viabilidade das células HepG2 utilizando Sulforodamina B mostrou perfil citotóxico tempo e concentração-dependente para fexinidazol-sulfona, sobretudo em concentrações a partir de 1mM. A determinação da CPD para o mesmo tipo celular revelou redução expressiva da proliferação celular a partir de 96 horas de tratamento com fexinidazol-sulfona, particularmente nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM. Os resultados demonstraram, no contexto do desenvolvimento farmacológico anti- T. cruzi, a importância da utilização do tempo de tratamento prolongado para avaliação da citotoxicidade de fármacos e podem auxiliar no delineamento de experimentos que contribuam para aumento do valor translacional dos estudos pré-clínicos de novos candidatos a fármacos.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da disbiose intestinal causada pela vancomicina durante a infecção pela bactéria Pseudomonas aeruginosa
(Universidade Federal de Alfenas, 2020-01-31) Pereira, Jéssica Assis; Almeida, Leonardo Augusto De; Santos, Hadassa Cristhina Azevedo Soares Dos; Peloso, Eduardo De Figueiredo
A Pseudomonas aeruginosa é uma das bactérias oportunistas mais comuns causadoras de infecções pulmonares em hospitais, e a vancomicina é amplamente utilizada em pacientes hospitalizados, influenciando sua microbiota intestinal. Dada a relevância da bactéria P. aeruginosa nos processos infecciosos e inflamatórios e estimulados pela necessidade de novas estratégias de tratamento, o objetivo deste trabalho foi analisar como o efeito da vancomicina sobre a microbiota intestinal murina pode favorecer ou não a infecção causada pela bactéria oportunista P. aeruginosa e como o uso do Transplante de Microbiota Fecal (TMF) pode atuar sobre essa resposta. Foi demonstrado neste trabalho que o conteúdo bacteriano fecal é alterado nos animais sob uso de vancomicina e que a disbiose intestinal acarretou na alteração do peso dos animais. Macrófagos derivados da medula óssea murina (BMDMs) estimulados com conteúdo cecal de camundongos em disbiose, apresentaram níveis mais altos de expressão de genes codificadores de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, enquanto a expressão de IL-10 foi diminuída. Como foi confirmado que a disbiose bacteriana intestinal foi causada pela vancomicina e que essa alteração estimula diferencialmente macrófagos, foi avaliado se essa alteração da microbiota bacteriana intestinal altera a resposta do hospedeiro frente à infecção pulmonar pela bactéria oportunista P. aeruginosa. A quantidade de P. aeruginosa viável nos pulmões, baços e fígados de camundongos em disbiose mostraram níveis mais elevados, com mais danos no pulmão e ceco, além de apresentarem aumento da expressão de IL-10 e maior recrutamento de células CD11b+ no lavado bronco-alveolar. O fenótipo suscetível e dano tecidual foram revertidos quando camundongos em disbiose receberam o transplante de microbiota fecal. Em conjunto, os resultados demonstram que a vancomicina altera a microbiota intestinal, induzindo a disbiose intestinal murina, e o TMF demonstrou ser uma excelente estratégia para restaurar a comunidade microbiana intestinal e auxiliar no controle e prevenção de infecções bacterianas oportunistas de caráter nosocomial. Entretanto, embora nossos resultados possam esclarecer a relação entre os pulmões e os intestinos, é necessária uma investigação mais aprofundada para entender a resposta imunológica no interior dos pulmões, bem como a influência da disbiose intestinal neste contexto.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da expressão de genes da resposta antioxidante de candida albicans na ausência e presença de concentrações subinibitórias de antifúngicos
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-08-09) Ferreira, Carla Benedini Ribeiro Jorge; Dias, Amanda Latercia Tranches; Melhem, Márcia De Souza Carvalho; Colombo, Fábio Antônio
Infecções fúngicas invasivas são consideradas um grave problema, principalmente no que se refere a pacientes imunocomprometidos e ao tratamento antifúngico. Dentre essas infecções, destacam-se as causadas pelo gênero Candida spp., principalmente C. albicans, por seus inúmeros fatores associados à virulência. Estas espécies apresentam inúmeros fatores associados à virulência e habilidade em evadir o sistema imune do hospedeiro, fazendo com que haja recorrência de infecções em âmbito hospitalar e na comunidade. No hospedeiro, as células fagocíticas respondem a diversos estímulos microbianos com a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), responsáveis, em parte, pela atividade microbicida dessas células, que atuam a nível proteico, lipídico e genético. Na resposta central frente ao ambiente oxidante encontra-se o gene CAP1, do inglês “adenylate cyclase-associated protein”, responsável pela ativação de diversos outros genes associados ao estresse oxidativo, e, cuja requisição à tolerância ao ambiente oxidante por C. albicans é conhecida. Ao decorrer da cascata antioxidante, outros genes são ativados, como os da família das SODs (SOD1-6) e catalase (CAT1), cujas funções são dismutar ERO tais como o superóxido e decompor o peróxido de hidrogênio, respectivamente. Os antifúngicos utilizados na clínica, tanto com finalidade profilática ou de tratamento, incluem anfotericina B, fluconazol e caspofungina, sendo de extrema importância os testes de sensibilidade para compor os guias terapêuticos de tratamento de candidíases. Tem sido atribuído a estes antifúngicos, como mecanismo de ação adicional, o aumento da produção de ERO, o que pode contribuir com o efeito positivo do tratamento, mas, em contrapartida, pode colaborar com o aumento da resistência do fungo a essas espécies. O trabalho objetivou avaliar o processo de fagocitose e a capacidade fungicida dos macrófagos frente às amostras tratadas com as concentrações subinibitórias dos antifúngicos anfotericina B, fluconazol e caspofungina, bem como a expressão diferencial dos genes CAP1, SOD1-6 e CAT1 em C. albicans SC4314, 121 e 221-V por RT-PCR. O tratamento com a caspofungina promoveu a maior expressão de, praticamente, todos os genes estudados, em todos isolados, porém todos os antifúngicos modularam, positiva ou negativamente, a expressão relativa de todos os genes. O pré-tratamento com a caspofungina parece ter protegido o fungo frente ao ataque de macrófagos. O tratamento com doses subinibitórias promove diversos tipos de estresse, dentre eles o oxidativo, o qual ocasiona alterações no perfil de transcrição de genes da resposta antioxidante e isso pode favorecer o fungo na luta contra o sistema imune do hospedeiro, podendo influenciar diretamente na terapia ou profilaxia antifúngica de doenças fúngicas invasivas de interesse médico.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da expressão e do papel dos microRNAs mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p durante a infecção pulmonar causada pela bactéria Pseudomonas aeruginosa
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-04-26) Tana, Fernanda De Lima; Almeida, Leonardo Augusto De; Prudêncio, Carlos Roberto; Malaquias, Luiz Cosme Cotta
Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno humano oportunista capaz de causar severas infecções em pacientes imunodeprimidos e em pacientes que apresentam fibrose cística. Para desencadear uma resposta efetiva contra a infecção pela P. aeruginosa é necessário uma primeira linha de reconhecimento desta bactéria pelo sistema imunológico inato. Apesar do desencadeamento da resposta imune inata ser benéfica no controle da infecção pela P. aeruginosa, esta resposta deve ser controlada. Estudos recentes têm começado a esclarecer como os miRNAs desempenham papéis fundamentais na regulação de processos como infecção, resposta imune e inflamação participando da modulação da resposta imune. Dada a relevância da bactéria P. aeruginosa nos processos infecciosos em humanos e estimulados pela necessidade de desvendar os mecanismos de regulação da reposta imune contra esta bactéria, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p expressos em camundongos infectados pelas cepas ATCC 27853 e PA14 da bactéria P. aeruginosa. Para avaliar o nível de expressão dos mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p e das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-12 in vitro, o RNA total foi extraído de células Raw 264.7, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) e de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) para análise de PCR em tempo real. Após a infecção das células Raw 264.7, BMDMs e BMDCs foi possível observar que a expressão dos miRNAs e das citocinas ocorreu de forma dependente em cada tipo celular infectado. Para as análises in vivo camundongos C57BL/6 foram infectados via intratraqueal com as cepas ATCC 27853 e PA14 de P. aeruginosa para análises de UFCs, RT-qPCR, histopatologia e estereologia. Apenas a cepa PA14 foi recuperada no pulmão e baço dos animais, onde não foi observado variação na expressão do mmu-miR-155-5p nem aumento significativo de uma série de citocinas efetoras. As análises histopatológicas demostraram intenso processo inflamatório difuso apresentando número maior de células inflamatórias, diminuição no número de alvéolos e do volume da estrela quando comparados aos animais não infectados e animais infectados pela cepa avirulenta. No pulmão dos animais infectados com a cepa ATCC 27853, observou-se aumento de expressão de mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p, das citocinas inflamatórias. A identificação das redes de regulação dos miRNAs em estudo mostrou importantes alvos diretos e indiretos associados à resposta imune inata que podem estar comprometidas durante a expressão diferencial de mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p em favorecimento ou em detrimento da resolução da infecção pela P. aeruginosa. Os resultados obtidos até o momento permitem sugerir que a infecção pela P. aeruginosa exerce uma modulação na expressão de miRNAs e consequentemente na resposta imune contra esta bactéria e que a virulência de diferentes cepas de P. aeruginosa influenciam na expressão dos miRNAs mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p, de citocinas pró-inflamatórias e na patologia. Mais estudos são necessários para desvendar os mecanismos pelos quais cepas virulentas da P. aeruginosa conseguem subverter a resposta imune e garantir a sua replicação no hospedeiro.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da frequência de polimorfismos de nucleotídeo único nos genes TNF-α, JAK1, VDR, DC-SIGN e FcγRIIa em pacientes com paracoccidioidomicose oral
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-07-26) Pereira Neto, Tertuliano Alves; Malaquias, Luiz Cosme Cotta; Almeida, Letícia De; Paranaíba, Lívia Máris Ribeiro
Fungos do complexo de espécies do gênero Paracoccidioides são agentes causadores da Paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica e endêmica na América Latina. Lesões orais ocorrem em aproximadamente 80% dos pacientes com a forma crônica e são caracterizadas pela presença de granulomas que podem indicar a extensão da doença, de acordo com sua organização. A evolução da doença depende não somente da virulênica do fungo, mas também da integridade da resposta imune e de fatores genéticos do hospedeiro. Dentre este último, destacam-se os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em vários componentes da resposta imunológica. Dentre os SNPs, cujas associações já foram descritas para diversas doenças infecciosas, destacam-se os presentes em genes como TNF-α, JAK1, VDR, DC-SIGN e FcγRIIa. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a frequência dos SNPs DC-SIGN (rs4804803), FcγRIIa (rs1801274), JAK1 (rs11208534), TNF-α (rs1800629) e VDR (rs7975232) em amostras de DNA de pacientes com PCM oral e verificar se há associações com o padrão de organização dos granulomas nas lesões. Para isso, foram utilizadas 66 amostras de DNA obtidas a partir de biópsias de lesões orais e suas respectivas lâminas para a classificação do granuloma e 106 amostras de DNA de indivíduos saudáveis. A genotipagem foi realizada pelo método de discriminação alélica por PCR em tempo real e os resultados demonstraram que no SNP VDR (rs7975232), o genótipo CC (p-valor<0,001, OR = 5,94, IC 95% 2,07 – 17,05) ou indivíduos que carregam o alelo C (p-valor = 0,027, OR = 2,71 IC 95% 1,07 – 6,86 para CC+AC) e o genótipo GG no DC-SIGN (rs4804803) (p-valor = 0,032, OR = 3,76, IC 95% 1,06 – 13,38) estão associados ao aumento do risco de desenvolvimento da PCM oral. Porém, não foram observadas correlações com o tipo de granuloma. Esses dados indicam que as variações derivadas dos SNPs VDR (rs7975232) e DC-SIGN (rs4804803) estão relacionadas à susceptibilidade da PCM oral nas amostras analisadas.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da imunogenicidade de epítopos da proteína estrutural spike do SARS-CoV-2 racionalmente selecionados por vacinologia reversa e associados ao BCG vacinal como carreador e indutor da imunidade inata treinada
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-10-06) Santos, Ana De Souza; Almeida, Leonardo Augusto De; Rodrigues, Marina Quádrio Raposo Branco; Novaes, Rômulo Dias
A COVID-19 está relacionada a uma síndrome respiratória aguda grave no trato respiratório inferior causada pelo SARS-CoV-2. Análises observacionais mostraram que pessoas vacinadas com o Bacilo Calmette-Guérin (BCG) têm menor probabilidade de desenvolver formas graves da COVID-19. Assim, foi hipotetizado que a associação desse bacilo com epítopos imunogênicos selecionados por técnicas de vacinologia reversa das proteínas estruturais do SARS-CoV-2 pode acarretar o desenvolvimento de uma resposta imune inata treinada capaz de aumentar a resposta imune protetora específica contra esse vírus. Assim, esse trabalho teve como objetivo identificar epítopos imunoestimulantes da proteína spike do SARS-CoV-2 e associá-los ao BCG vacinal para a estimulação de uma resposta imune inata treinada. Para isso, 53.838 genomas depositados em bancos de dados do SARS-CoV-2 foram utilizados e as putativas sequências proteicas preditas da spike do vírus foram alinhadas para a determinação de uma proteína consenso mundial. A estrutura dessa proteína foi predita por modelagem molecular e foi possível identificar dois peptídeos de maior promiscuidade de se ligar aos BCR, MCH-I e MHC-II, assim como as características quanto a estabilidade, imunogenicidade, não alergenicidade, e com propriedades físico- químicas compatíveis para o desenvolvimento de peptídeos imunogênico. Por ancoragem molecular foi possível identificar os pontos e as forças de interação com as moléculas de MHC. O epítopo 1 apresenta pontos de alterações já identificadas nas variantes do novo coronavírus, assim como um ponto de n- glicosilação. Por outro lado, o epítopo 2 não se encontra em posições de alta variabilidade nas variantes em circulação no momento, incluindo a nova variante ômicron. Duas formulações contendo o BCG e cada peptídeo foram utilizadas para estimular macrófagos derivados da medula óssea murina demonstrando um aumento expressivo na secreção de IL-6, IL-1 e TNF- quando do contato prévio com essa formulação. Ademais, a via de MAPK se mostrou mais ativada nessas células com destaque para maior ativação de p38. Análises in vivo, utilizando camundongos C57BL/6 vacinados intramuscularmente com as formulações, mostraram um aumento expressivo na produção de IgG total, IgG1 e IgG2c específicos para os peptídeos da proteína spike no soro, assim como a secreção aumentada de IFN-, IL-6, TNF-α e IL-17. Em suma, a abordagem racional de predição de epítopos imunogênicos ao serem associados ao BCG vacinal foi capaz de induzir a imunidade efetiva tanto inata quanto adaptativa em modelos in vitro e in vivo.

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