Mestrado em Ciências Biológicas

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Análise do efeito adjuvante de nanopartículas de albumina sérica bovina na imunização de camundongos utilizando a proteína não estrutural 1 do Dengue vírus
(Universidade Federal de Alfenas, 2016-12-08) Silva, Natalia Ingrid Oliveira Da; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Marques, Marcos José; Drumond, Betânia Paiva
A dengue é uma doença viral, sistêmica, considerada endêmica em mais de 128 países, com cerca de 3,9 bilhões de pessoas no mundo vivendo em áreas de risco de infecção. O vírus da dengue é transmitido para humanos através da picada de mosquitos fêmeas do gênero Aedes infectadas. DENV é um vírus de RNA com polaridade positiva pertencente á família Flaviviridae, gênero Flavivirus. O desenvolvimento de uma vacina que confira imunidade de forma segura e eficiente, contra os quatro sorotipos do DENV é considerado prioritário. A proteína NS1, conservada entre sorotipos do DENV (1-4), está relacionada a processos imunopatológicos observados nas formas mais graves da dengue, sendo responsável pela indução da produção de citocinas inflamatórias e aumento da permeabilidade endotelial via ativação de receptores do tipo Toll 4. Pesquisas sugerem o uso da NS1 como candidato vacinal contra dengue, uma vez que a vacinação com NS1 recombinante foi capaz de proteger camundongos contra doses letais de sorotipos homólogos e heterólogos do DENV. Estudos preliminares do nosso grupo mostram que nanopartículas de albumina sérica bovina (NPBSA) são promissores sistemas vacinais de entrega de antígenos do DENV e outros antígenos microbianos, pois possuem, provavelmente, uma atividade adjuvante. Assim, este estudo teve como objetivo verificar o potencial adjuvante das NPBSA em induzir a produção de anticorpos anti-NS1 em camundongos. Os resultados obtidos indicam que as NPBSA não apresentaram citotoxicidade significativa em culturas de células macrofágicas RAW 264.7 e células fibroblásticas BHK-21, porém, as NPS foram capturadas mais facilmente pelas células RAW 264.7 do que por células BHK-21. A NS1 do DENV-1 foi expressa em sistema procarioto e depois utilizada como antígeno. A administração subcutânea das NPs em camundongos na presença ou ausência da proteína NS1 foi capaz de induzir o recrutamento de um infiltrado inflamatório nos locais onde a mesma foi aplicada. Após a imunização, foi observado que as NPBSA foram capazes de induzir a produção de anticorpos IgM anti-NS1 em 60% dos animais imunizados e IgG anti-NS1 em 80%. Estes dados podem estar relacionados com o perfil adjuvante das NPs, que ao serem administradas associados a NS1, foram capazes de induzir uma troca de classe mais rápida, levando à produção de plasmócitos secretores de IgG. Estudos futuros serão realizados para verificar se os anticorpos produzidos são capazes de inibir a ligação da NS1 ao receptor Toll 4 e diminuir assim, a produção de citocinas pró-inflamatórias responsáveis pelo aumento da permeabilidade vascular e extravasamento de plasma.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação de plataformas vacinais experimentais contra o Zika virus utilizando nanopartículas de albumina sérica bovina
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-01-25) Souza, Gabriel Augusto Pires De; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Campos, Rafael Kroon; Caldas, Ivo Santana
O Zika virus (ZIKV) é considerado um Flavivirus emergente e foi associado a epidemias em ilhas na região do Oceano Pacífico e em vários países das Américas. Paralelemente, manifestações graves como a microcefalia e síndrome de Guillain- Barré tiveram a sua incidência aumentada durante estes surtos e contribuíram para o estabelecimento de um estado de emergência pela Organização Mundial da Saúde (OMS). A partir de então, o desenvolvimento de uma vacina eficaz para prevenir infecções causadas pelo ZIKV tornou-se uma prioridade, uma vez que não há vacinas para o ZIKV em estágios avançados de desenvolvimento, o que, fortalece a necessidade de testar plataformas alternativas. Estudos preliminares do nosso grupo mostraram que as nanopartículas de albumina sérica bovina são sistemas promissores de vacinas para antígenos microbianos. Portanto, devido à falta de vacinas disponíveis para o ZIKV e aos resultados anteriormente obtidos pelo nosso grupo, este estudo teve como objetivo caracterizar e avaliar a capacidade de nanopartículas de albumina sérica bovina (BSA-NPs) associadas ao vírus inativado em induzir a produção de anticorpos específicos contra o ZIKV Ensaios in vitro foram realizados para avaliar a citotoxicidade da formulação e também para avaliar a taxa de interiorização de nanopartículas por célula permissiva ao ZIKV. Finalmente, os animais foram imunizados com as nanopartículas contendo ZIKV inativado encapsulado (NPZ) ou uma mistura composta de BSA-NPs e ZIKV (NP+ZIKV). Anticorpos IgG anti-ZIKV produzidos foram mensurados no soro dos animais imunizados por ELISA. Os resultados indicam que a plataforma nanométrica NPZ possui morfologia esférica irregular de 226.1 ± 3.4 nm de diâmetro e -15.9 ± 1.0 mV de carga superficial. A detecção de genoma de viral em NPZ indica a presença do encapsulamento do ZIKV nas nanopartículas, com porcentagem de eficiência média de encapsulamento de 96%. Ensaios in vitro mostram que as nanopartículas foram interiorizadas pelas células VERO, sem qualquer citotoxicidade significativa. Camundongos imunizados com NPZ não demonstraram produção significativa de anticorpos IgG totais específicos, enquanto o grupo de animais imunizados com NP+ZIKV mostraram uma produção significativa de IgG total e IgG1 anti-ZIKV em relação aos animais imunizados apenas com o ZIKV inativado. Os dados evidenciam o potencial adjuvante das BSA-NPs na elaboração de uma vacina eficaz contra o ZIKV. Futuros estudos deverão ser conduzidos para determinar se os anticorpos produzidos possuem ação neutralizante e se estes anticorpos são capazes de proteger animais susceptíveis da infecção pelo ZIKV.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação do efeito de nanopartículas de albumina sérica bovina associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico poli (I:C) sobre o fenótipo de células dendríticas.
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-03-26) Vieira Júnior, João Carlos Vilela; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Magalhães, José Carlos De; Marques, Marcos José
Nanopartículas são estruturas microscópicas que possuem dimensões na faixa de tamanho em torno de 1 nm a 100 nm. As nanopartículas podem atuar como sistemas de entrega de antígenos em formulações vacinas. A maioria das nanopartículas (NPs) possui baixa toxicidade quando são inoculadas ou injetadas em animais. A magnitude da toxicidade das NPs depende de inúmeros fatores, tais como material, via de administração da exposição, tamanho e forma. Elas podem induzir inflamação envolvendo neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e outras células efetoras. As células dendríticas (DCs), possuem papel fundamental na mediação da resposta imune inata e na indução da resposta imune adaptativa. A albumina é um polímero natural, biocompatível, biodegradável, não tóxico e não imunogênico e, devido a essas características, as NPs feitas de albumina são promissores sistemas de administração de medicamentos ou antígenos. O presente trabalho possui o objetivo, de produzir e avaliar o efeito de nanopartículas de albumina sérica bovina (BSA) associadas ao ácido poliinosínico-policitidílico (NPPI) sobre o fenótipo de células dendríticas derivadas de medula óssea. No preparo das NPPI foi utilizada a técnica de co-acervação e ligação cruzada com glutaraldeído. Foi feita a análise por DLS, que mostrou que as nanopartículas produzidas em dois pHs testados (5,0 e 7,0) apresentaram resultados discordantes em relação ao tamanho, carga e PDI. As NPPI produzidas em pH 7,0 tiveram um menor tamanho e menor índice de PDI, a partir de então todos os experimentos foram realizados com esse pH. O tamanho da partícula, a sua distribuição e o potencial Zeta foram determinados pela técnica de espalhamento dinâmico de Luz. A morfologia das NPs foi determinada por microscopia de força atômica. As NPPI apresentam tamanho de 497±140,4 nm, carga de -33,66±3,93 mV, PDI de 0,38±0,06 e forma esférica. As análises para determinar a taxa de encapsulamento indicam que se obteve 100% de encapsulamento do ácido poliinosínico-policitidílico poli (I:C). Células da medula óssea de camundongos C57BL/6 foram obtidas e diferenciadas em células dendríticas. Para verificar a estabilidade das NPPI em diferentes temperaturas, estas foram incubadas a 4oC e 37oC por 1, 2, 4 e 7 dias. O primeiro parâmetro a ser analisado foi a quantificação de poli (I:C) no sobrenadante das nanopartículas após a incubação. Os resultados indicaram, que os valores de densidade de ótica (D.O), foram relativamente baixos, indicando que não houve a liberação de poli (I:C) até o sétimo dia de análise. As células foram tratadas com as nanopartículas por 48 horas e o estado de ativação e maturação das células dendríticas foi monitorado através de qPCR para o mRNA IFN-β, CD40 e CD86. Os resultados indicaram um aumento da expressão do mRNA dos genes IFN-β e CD40 nas células tratadas com NPPI. A análise histopatológica da pele de animais inoculados com NPPI demonstrou o recrutamento de células inflamatórias na pele. Os animais do grupo NPVs, apresentaram áreas epidérmicas livre de queratina, e leve aumento da celularidade na derme profunda. Os animais dos grupos NPPI e poli (I:C) apresentaram padrão morfológico epidérmico semelhante ao grupo PBS. Em relação a contagem de células no tecido analisado foi possível observar um aumento significativo da celularidade em todos os grupos tratados com nanopartículas (NPPI, NPVs) e no grupo inoculado com poli (I:C). Portanto, os resultados demonstraram o potencial das NPPI em serem utilizadas como adjuvante em plataformas vacinais.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação do potencial vacinal de nanopartículas de albumina sérica bovina conjugadas a antígenos totais de Pseudomonas aeruginosa em modelo de infecção pela Cepa Virulenta de P. aeruginosa
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-02-02) Morais, Stella Maria De Souza; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Rodrigues, Juliana Falcão; Dias, Amanda Latércia Tranches
Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista que causa infecções severas em indivíduos imunocomprometidos e em pacientes com fibrose cística. Alguns candidatos vacinais para prevenir infecções causadas por P. aeruginosa já foram testados, porém ainda não está disponível no mercado nenhuma vacina contra esse patógeno. Nanopartículas (NPs) poliméricas biodegradáveis podem ter atividade adjuvante, de modo que se apresentam como candidatos promissores para a produção de vacinas se associadas aos antígenos vacinais. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial das NPs de albumina sérica bovina (BSA) associadas aos antígenos totais de P. aeruginosa ATCC 27853 em induzir proteção contra a infecção utilizando a cepa virulenta de P. aeruginosa PA14 em modelo murino. NPs de BSA associadas aos antígenos totais de P. aeruginosa ATCC 27853 e NPs vazias foram utilizadas para a análise da taxa de captura e para a avaliação da citotoxicidade, empregando células RAW 264.7 e BHK-21. Para análise da imunogenicidade das NPs, camundongos Swiss foram imunizados com NPs associadas aos antígenos totais de P. aeruginosa (NPPa) ou NPs vazias. Como controle positivo e negativo, grupos de animais foram imunizados com antígenos totais de P. aeruginosa ATCC 27853 e solução salina tamponada, respectivamente. A produção de anticorpos IgG anti-P. aeruginosa e anti-BSA foi avaliada por meio de ELISA. Em seguida, foi caracterizada a infecção pela P. aeruginosa PA14 nos animais imunizados com as NPs, avaliando-se a sobrevivência dos animais após a infecção, a carga bacteriana nos pulmões, a produção de citocinas e parâmetros histopatológicos. Verificou-se que os animais imunizados com NPPa apresentaram produção de anticorpos IgG anti-P. aeruginosa e anti-BSA. Após a infecção com a P. aeruginosa PA14, observou-se que os animais imunizados com NPPa foram os que apresentaram a maior porcentagem de sobrevivência, a menor carga bacteriana pulmonar, a produção mais controlada de citocinas e poucas alterações histopatológicas. Esses resultados indicam que as imunizações com NPPa protegeram os camundongos da infecção, contribuindo para a eliminação da bactéria dos pulmões, o que consequentemente refletiu na sobrevivência dos animais.
Acesso aberto (Open Access)
Efeito adjuvante de nanopartículas de albumina sérica bovina contendo Poli (I:C) em camundongos imunizados com o domínio III da proteína do envelope do Zika virus
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-11-10) Amaral, Raíne Piva; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Rocha, Raissa Prado; Castro, Lívia De Figueiredo Diniz
O Zika virus (ZIKV) é considerado um Flavivirus emergente associado a epidemias em ilhas na região do Oceano Pacífico e em vários países das Américas. Manifestações graves como a síndrome congênita do Zika e síndrome de Guillain-Barré tiveram a sua incidência aumentada durante estes surtos e contribuíram para o estabelecimento de um estado de emergência pela Organização Mundial da Saúde (OMS). A partir de então, o desenvolvimento de uma vacina eficaz para prevenir infecções causadas pelo ZIKV tornou-se uma prioridade, uma vez existem poucas vacinas para o ZIKV em estágios avançados de desenvolvimento, fotalecendo a necessidade de testar plataformas alternativas. As nanopartículas (NPs) são materiais particulados que apresentam tamanhos variando entre 10 a 1000 nm. As NPs são sistemas coloidais formados por estruturas complexas, os quais têm o potencial de evitar a degradação enzimática do fármaco ou do antígeno de interesse e assim prolongar a exposição ao princípio ativo por meio da liberação controlada. As NPs poliméricas estão sendo amplamente exploradas como novas plataformas vacinais devido à capacidade dessas NPs em estimular o sistema imunológico, proporcionando desta forma, a liberação controlada do antígeno após a sua administração. A albumina é um polímero natural, biocompatível, biodegradável, não tóxico e, devido a essas características, as NPs feitas de albumina sérica bovina (NPs-BSA) são promissores sistema de administração de medicamentos ou antígenos. Diante disso, este trabalho teve como objetivo avaliar se a formulação preparada de nanopartículas compostas de albumina sérica bovina e ácido poliinosínico-policitidílico (NPPI) quando adicionadas a uma solução contendo o domínio III da proteína do envelope do ZIKV (zEDIII) são capazes de induzir anticorpos neutralizantes. Para isso, camundongos fêmeas foram imunizados pela via subcutânea com nanopartículas contendo ácido poliinosínico-policitidílico (NPPI) com ou sem adição do domínio III da proteína do envelope do ZIKV (zEDIII) nos dias 0, 7 e 14. A produção de anticorpos IgG anti-zEDIII foram avaliados por ELISA. Os soros dos animais previamente imunizados foram transferidos passivamente a camundongos neonatos de um dia de idade após uma hora de infecção por ZIKV. Os neonatos foram acompanhados e avaliados quanto ao peso, sinais clínicos e neurológicos durante 28 dias ou até o dia de sua morte. Os cérebros desses animais foram coletados para ensaios de quantificação de carga viral. Os resultados mostraram que camundongos imunizados NPPI+zEDIII produziram títulos significativos de anticorpos IgG anti-zEDIII. Essa imunização também foi capaz de induzir a produção de anticorpos neutralizantes, capazes de neutralizar potencialmente a infecção pelos ZIKV in vitro. Além do mais, o soro dos animais imunizados com NPPI+zEDIII foi capaz de prevenir os sinais clínicos e neurológicos em um modelo de transferência passiva de anticorpos a animais neonatos, além de reduzir a carga viral, expressão de citocinas pró- inflamatórias e inflamação no cérebro desses animais. Portanto, nossos resultados mostram que NPPI+zEDIII é um candidato vacinal promissor para combater infecções causadas pelo ZIKV.
Acesso aberto (Open Access)
Revisão sistemática de marcadores de resistência e/ou susceptibilidade de Biomphalaria sp. à infecção por Schistosoma mansoni
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-09-12) Monteiro, Anndreisa Christiny; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Vashist, Usha; Caldas, Ivo Santana
A esquistossomose é uma doença endêmica que acomete mais de 200 milhões de pessoas no mundo todo. É sabido que vários fatores podem interferir para o sucesso ou não de uma infecção do Schistosoma mansoni em seu hospedeiro intermediário, tais como fatores comportamentais, genéticos e imunológicos do caramujo. No entanto, a complexidade dos mecanismos de resistência e/ou suscetibilidade do molusco, ainda não foram totalmente esclarecidos. Compreendendo esta importância o presente estudo objetivou realizar uma revisão sistemática sobre os fatores de resistência e/ou suscetibilidade à infecção dos moluscos pelo Schistosoma mansoni. Uma pesquisa sistemática foi realizada nas bases de dados PUBMED, SCOPUS e WEB OF SCIENCE. A presente revisão identificou 189 trabalhos, das quais 66 foram elegidos para inclusão nesta revisão sistemática. Foi observado que a maioria dos estudos foi desenvolvida em países desenvolvidos e indenes à doença, tais como Estados Unidos e Reino Unido. A maioria dos estudos focou no uso de linhagens de Biomphalaria glabrata derivadas do Brasil e Caribe infectadas com cepas oriundas destas duas regiões geográficas (n=58/87,88%). Foram identificados 71 fatores relacionados à resistência e 41 relacionados à susceptibilidade do hospedeiro intermediário à infecção. Os processos biológicos relacionados a esses fatores foram diversos, se destacando principalmente processos relacionados ao estresse oxidativo, resposta imunológica e estresse celular. Dentre estes os genes identificados, os que foram mais citados nos trabalhos elegidos foram os que codificam a enzima Superoxido dismutase (SOD1) e a proteína do choque térmico 70 (HSP70), os quais foram mais citados como fatores de resistência à infecção. Apesar desta revisão indicar vários fatores de resistência e/ou susceptibilidade do hospedeiro intermediário à infecção por S. mansoni, ainda é necessário investir em pesquisas que visam estudar este aspecto da relação parasita-hospedeiro intermediário, para identificar com mais clareza os principais genes e vias biológicas relacionadas com a resistência ou susceptibilidade do Biomphalaria sp. à infecção por S. mansoni.
Acesso aberto (Open Access)
Transcriptoma integrativo de células humanas tratadas com diferentes tipos de nanopartículas
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-02-23) Rodrigues, João Francisco Vitório; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Pereira, Anna Carolina Toledo Da Cunha; Burger, Eva
Nanopartículas (NPs) são partículas que possuem tamanho inferior a 100 nM. As NPs podem ser produzidas de diversos materiais orgânicos e inorgânicos e em diversas formas (por exemplo nanotubos, nanoesferas e nanobastões). Esta tecnologia apresenta potencial promissor para várias aplicações biológicas tendo em vista a sua possibilidade de funcionalização, o que permite o seu direcionamento seletivo para órgãos, tecidos e células. A aplicabilidade na saúde humana está relacionada ao uso das NPs como estimuladores do sistema imune quando conjugados com antígenos, no uso para o diagnóstico e tratamento de tumores e para a entrega de medicamentos em determinados tecidos e órgãos. Apesar do uso das NPs em novos sistemas de diagnóstico, tratamento ou prevenção para doenças humanas, poucos estudos são realizados para verificar o efeito das NPs sobre o transcriptoma celular. A análise integrativa de transcriptoma (ITA) é atualmente reconhecida como uma técnica promissora para a compreensão de eventos biológicos a partir da análise de diversos transcriptomas depositados em bancos de dados públicos. Essa abordagem permite não só avaliar quais genes são diferentemente expressos nas diversas condições, mas também é capaz de inferir sobre suas as respectivas vias biológicas ativadas após um determinado estímulo. Nessa pesquisa foram identificados 81 transcriptomas derivados de células humanas tratadas com NPs no banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO). Destes, 45 foram selecionados por serem transcriptomas de células tratadas com NPs compostas apenas de um material (sem associação ou conjugação com nenhuma outra substância ou material) e células não tratadas. Os demais foram excluídos por terem dados incompletos, não terem sido realizados em duplicatas, falta de grupo controle, e por serem de dados derivados de células tratadas com NPs composta por mais de um material. Assim sendo, devido a variabilidade desses estudos, somente foram selecionados transcriptomas de células tratadas com NPs por 24 horas. Dessa forma, foram utilizados 30 conjuntos de dados que compreendem transcriptomas derivados de 5 materiais e 6 células diferentes. A ITA utilizou os genes diferencialmente expressos (DEGs) identificados em cada um dos transcriptomas e demonstrou que existe uma especificidade na resposta celular aos diferentes tipos de NPs. Poucos DEGs apresentaram expressão em comum à dois ou mais transcriptomas analisados. A análise de vias biológicas apresentou uma diversidade de vias ativadas e suprimidas pelos diferentes tratamentos com poucas vias compartilhadas entre os diferentes transcriptomas analisados. Portanto, a ITA de células humanas tratadas com diferentes tipos de NPs demonstra uma resposta transcricional específica e dependente do tipo de material utilizado na nanopartícula e do tipo celular.

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