Mestrado em Ciências Biológicas

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Navegando Mestrado em Ciências Biológicas por Orientador(a) "Padovan, Ana Carolina Barbosa"

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Análise da localização, da expressão gênica e predição estrutural de adesinas hipotéticas no patógeno emergente Trichosporon asahii
    (Universidade Federal de Alfenas, 2019-02-28) Lima, Alexandre Anderson De; Padovan, Ana Carolina Barbosa; Gouveia, Viviane Alves; Dias, Amanda Latércia Tranches
    O gênero Trichosporon spp. pertence ao filo Basidiomycota e atualmente conta com 12 espécies, sendo Trichosporon asahii a que possui maior relevância clínica, causando infecções invasivas que alcançam uma taxa de mortalidade de até 80%, o que depende do estado imunológico do paciente, da capacidade do fungo em crescer em diferentes morfologias e da susceptibilidade limitada aos antifúngicos, bem como, de sua capacidade de formar biofilmes. A formação de biofilmes depende da síntese de adesinas que medeiam as interações célula-meio nas diferentes morfologias do fungo. Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram verificar se proteínas com função preditiva de adesinas são expressas em leveduras e hifas de T. asahii e se são encontradas na superfície celular deste fungo, bem como analisar os modelos tridimensionais dessas adesinas. Para isso, camundongos isogênicos 129/Sv foram inoculados com extrato de proteínas totais de leveduras e de hifas para geração de antissoros policlonais que foram avaliados por ensaio imunoenzimático (ELISA), mostrando que houve diferença na quantidade de anticorpos gerados contra as proteínas totais de leveduras e hifas e que os mesmos reconheceram diferencialmente os extratos proteicos opostos aos quais foram produzidos de forma significativa (p<0,05), e que os anticorpos gerados contra proteínas de hifas possuem maior força de ligação. Os antissoros policlonais foram utilizados em ensaios de microscopia de imunofluorescência, ambos contra leveduras e contra hifas, mostrando reconhecimento das diferentes morfologias de forma semelhante e independente das células terem passado por tratamento de permeabilização ou não. Além disso, quatro proteínas previamente caracterizadas in silico por nosso grupo como potenciais adesinas (Restina-like, CFL1-like, Mar-like e Beta-like) tiveram sua estrutura proteica terciária modelada no servidor I-TASSER. A partir de cinco modelos gerados para cada adesina foi escolhido aquele que apresentou o maior valor de confiança (C-score). Em seguida, as sequências de aminoácidos das proteínas foram analisadas no programa TepiTool no NetMHCII para identificar peptídeos reconhecidos por alelos do MHC classe II humanos e H2 murino. Os peptídeos foram então, analisados no programa VaxiJen v. 2.0 para verificar a imunogenicidade dos mesmos, com ponto de corte > 0,5. Em seguida, os peptídeos de cada proteína foram localizados na estrutura 3D de cada proteína no programa PyMol 3.1. Finalmente, foram selecionados aqueles que se encontraram na superfície de cada modelo proteico e próximos à região N-terminal. Estes peptídeos foram sintetizados por empresa comercial e inoculados em camundongos para produção de antissoro específico contra cada peptídeo. Através dos anticorpos policlonais gerados contra cada peptídeo, proteínas de superfície foram detectadas na superfície de leveduras e de hifas de T. asahii. O ensaio piloto de reconhecimento de proteínas por Western blot não trouxe conclusões definitivas a repeito da eficácia do reconhecimento das adesinas pelos anticorpos gerados contra os peptídeos. A análise de expressão gênica das quatro potenciais adesinas em leveduras e hifas mostrou que todas são sintetizadas em maior grau nas hifas de T. asahii. A partir das estruturas 3D das quatro adesinas foi realizado ensaio in silico de docking molecular, mostrando que todas as quatro adesinas se ligam a proteínas humanas que são alvo da adesão celular de patógenos. Este trabalho contribuiu para a compreensão da interação molecular entre o patógeno emergente T. asahii e os tecidos de seu hospedeiro humano.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Caracterização molecular e análise da expressão gênica de adesivas na levedura emergente Trichosporon asahii
    (Universidade Federal de Alfenas, 2018-02-27) Jesus, Daniel Felipe Freitas De; Padovan, Ana Carolina Barbosa; Almeida, Patrícia Paiva Corsetti De; Chaves, Guilherme Maranhão
    O gênero Trichosporon está classificado no filo Basidiomycota, é composto por 12 espécies, sendo Trichosporon asahii, a mais relevante clinicamente, causando infecções invasivas com mortalidade de até 80%. Isso deve-se não só o estado imunológico do paciente, mas também, a falhas nos tratamentos e formação de biofilmes em materiais implantados (cateteres), sendo resistente aos antifúngicos. A formação de biofilme depende de adesinas, que medeiam diferentes interações célula-meio, constituindo importante fator de virulência, que em Trichosporon nunca foram caracterizadas. Deste modo, o presente trabalho tem por objetivo caracterizar molecularmente genes codificadores de proteínas com potencial função de adesão. Para isso, foram realizadas buscas (tBLASTn-NCBI) por genes hipotéticos de adesinas no genoma da linhagem de referência de T. asahii CBS2479, depositado em banco genômico, a partir de 23 adesinas conhecidas de Candida albicans e Cryptococcus neoformans. Além disso foi analisado o seu proteoma por meio dos programas de predições de adesinas FungalRV e Faapred. No servidor CBS prediction, realizou-se predições de peptídeo sinal, via de secreção, presença de hélices transmembrana, glicosilações, manosilações e acetilações. Após essa seleção, realizou-se extração do DNA total dos quatro isolados de T. asahii (CBS2479, CBS7631, L2585 e L773) e PCR convencional, para verificação da existência das sequências. Em seguida prosseguiu-se com extração de RNA total dos quatro isolados cultivados de modo planctônico para análise de expressão gênica. Pelo tBLASTn revelou-se 1 proteína com 30% de identidade e 85% de similaridade com CFL1p de C. neoformans. Pelo FungalRV e Faapred, foram preditas 16 sequências em comuns como adesinas, sendo secionados 17 pelos 3 programas de análise. Após aplicação de critérios de inclusão como tamanho da proteína (≥300 aminoácidos), presença de regiões conservadas que indiquem função de adesão, presença de peptídeo sinal e ausência de hélices transmembrana, foram selecionados 4 genes para estudo. A primeira proteína, CFL1p-like, contém 325 aminoácidos e apresenta O-glicosilações em 4 resíduos de serina/treonina (ser/thr), sem predição para N-glicosilações, com presença de sítios de ligações de manoses em 14 resíduos de trioptofano (trp) e ausência de predição para de N-acetilação. A proteína Beta-like contém 1383 aminoácidos com 463 possíveis resíduos passiveis de O-glicosilações e 21 sítios preditos para N-glicosilações, não apresentando sítios de C-manosilação e N-acetilação. Já a terceira foi chamanda de Restina-like e contém 507 aminoácidos com 101 resíduos passíveis de receber O-glicosilação, sem sítios de N-glicosilação e N-acetilação, mas foi predita C-manosilação em apenas um resíduo. A última proteína selecionada contém 406 aminoácidos, com 65 resíduos passíveis de O-glicosilação e 12 de N-glicosilação, sendo ausentes sítios de C-manosilação e N-acetilação. Os quatro genes foram amplificados nos quatro isolados por meio da PCR convencional, e verificou-se por RT-PCR que todos os genes selecionados se apresentavam expressos nas linhagens. Os genes MAR-like, RES-like e BETA-like foram mais expressos na linhagem CBS2479 provenientes de micose de pele, demonstrando que o sítio de isolamento pode influenciar na expressão. Não foi possível relacionar a expressão gênica com capacidade de formação de biofilme dos isolados de hemocultura em crescimento planctônico. Contudo, as análises de expressão demonstram que o gene CFL1-like foi mais expresso nas de hemocultura CBS7631 e L773 que apresentavam morfologia predominante de artroconídeos, ao invés daquelas com morfologia filamentosa. Este trabalho ainda contribuiu para a anotação genômica das ORFs referentes aos genes, com modificação de hipotéticas para verificadas, ao identificar potenciais genes codificadores de adesinas no filo Basidiomycota utilizando como modelo, o patógeno emergente T. asahii.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Identificação de candidatos vacinais em potencial para Trichosporon asahii por vacinologia reversa
    (Universidade Federal de Alfenas, 2018-09-21) Lopes, Paloma Da Silva Gomes; Padovan, Ana Carolina Barbosa; Almeida, Patrícia Paiva Corsetti De; Castro, Lívia De Figueiredo Diniz
    Os membros do gênero Trichosporon são leveduras do filo Basidiomycota sendo considerados patógenos oportunistas em pacientes imunocomprometidos. Trichosporon asahii já apresenta indícios de resistência à vários antifúngicos e é um dos principais causadores de infecções invasivas em humanos. Apesar de sua importância clínica, ainda não existem vacinas e imunoterapias para prevenir a doença nos principais grupos de risco. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo central identificar potenciais candidatos vacinais para direcionar a produção de imunobiológicos que possam conferir proteção a pacientes, através da tecnologia de vacinologia reversa, na qual não há necessidade de cultivar o microrganismo em laboratório, o que favorece a criação de uma vacina mais rápida. Para isso foram realizadas análises in silico utilizando o proteoma predito de T. asahii com 8.300 proteínas putativas, depositado no NCBI. Por análises do proteoma nos programas CELLO v.2.5 e PSORT II, 268 proteínas comuns foram preditas como extracelulares. A predição de imunogenicidade das mesmas foi realizada no programa VaxiJen v2.0, no qual foram obtidas 205 proteínas com potencial imunogênico (score ≥ 0.5). As proteínas selecionadas foram comparadas com o proteoma humano, através do BLASTp-NCBI. Das 205 analisadas, foram selecionadas 137 que não tiveram similaridade com proteínas humanas. Para identificar candidatos vacinais que poderiam induzir proteção cruzada, essas proteínas que não tiveram similaridade com proteínas humanas foram comparadas com as proteínas dos gêneros Cryptococcus spp. e Candida spp., através do BLASTp-NCBI. Os resultados indicaram a presença de 82 proteínas com similaridade com as proteínas de Cryptococcus spp. e 11 com Candida spp. Ao se selecionar aquelas com caracterização funcional e com similaridade e cobertura entre sequências > 50%, foi evidenciado que apenas 5 do gênero Cryptococcus spp. cumpriram os critérios de seleção. As 44 proteínas restantes que não obtiveram similaridade com nenhum dos gêneros fúngicos similares a Trichosporon spp. foram analisadas para identificar candidatos vacinais que poderiam induzir uma proteção somente contra T. asahii. O critério de seleção adotado foi analisar apenas proteínas que possuíam caracterização funcional por ontologia gênica com gêneros de fungos que já tiveram seus proteomas anotados, sendo que, das 44 proteínas, apenas 3 possuíam caracterização funcional. A partir disso, as 8 proteínas selecionadas tiveram seus epítopos mapeados através da ferramenta Tepitool para avaliar a capacidade de ligação ao MHC II em células T, sendo que todas as proteínas possuíam epítopos que se ligaram aos alelos HLA do MHC II. Em seguida, todos os epítopos com ligação ao MHC II foram analisados no programa VaxiJen 2.0, para avaliar sua capacidade imunoestimulante, com score > 0.5. Foram encontrados o mínimo de 20 epítopos imunoestimulatórios para proteção contra T. asahii na proteína Cutinase, e o máximo de 43 na proteína Curculin domain protein (mannose-binding) lectin, e para proteção cruzada, o mínimo de 18 epítopos e um máximo de 54, nas proteínas Major allergen Asp F2 e Glioxal oxidase precursor, respectivamente. Em seguida, foi realizada modelagem molecular das 8 proteínas através do software I-TASSER, para facilitar a localização dos epítopos imunogênicos, visualizados em 3D através do software VMD. Finalmente, foi realizada a cobertura populacional mundial dos epítopos para avaliar as diferentes especificidades de ligação aos HLA e para selecionar aqueles epítopos com maior cobertura na população humana. Foram selecionados 71 epítopos imunogênicos externos para proteção exclusiva para T. asahii e 132, para proteção cruzada de T. asahii e Cryptococcus spp., com uma taxa de cobertura mundial de 99.98%, indicando que alguns epítopos são ótimos candidatos vacinais para a criação de uma vacina com proteção exclusiva contra T. asahii e com proteção cruzada entre o gênero Cryptococcus spp. e T. asahii, respectivamente.