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Acesso aberto (Open Access)
Abordagem racional de imunoinformática para o desenvolvimento de candidatos vacinais multiepítopos do SARS-CoV-2 e Mpox vírus
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-02-28) Santos, Natália Cristina De Melo; Almeida, Leonardo Augusto De; Santos, Thaís Cristina Ferreira Dos; Veras, Flávio Protásio
As doenças emergentes e reemergentes simbolizam uma ameaça crescente à saúde global, influenciadas por fatores como globalização, mudanças climáticas e interações humanas com animais. A pandemia de COVID-19 é um exemplo recente que evidencia a ameaça crescente dessas doenças à saúde pública global, enfatizando a necessidade de estratégias eficazes para lidar com doenças zoonóticas, como o recente surto reemergente da varíola dos macacos. A vacinação é uma das abordagens mais eficazes para a proteção contra doenças infecciosas. No entanto, o desenvolvimento de vacinas é um procedimento complexo e demorado, mas que pode ser otimizado empregando a vacinologia reversa, que utiliza técnicas in silico para identificação e escolha de antígenos. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi desenvolver potenciais candidatos vacinais para a COVID-19 e a varíola dos macacos. O trabalho está estruturado em dois capítulos, com o primeiro abordando a construção de proteínas quiméricas utilizando epítopos do vírus SARS-CoV-2, e o segundo na construção de uma proteína quimérica com epítopos obtidos por meio de abordagem imunoinformática para o vírus Mpox. As proteínas obtidas demonstraram estabilidade, antigenicidade e ausência de potenciais riscos alergênicos. Além disso, por meio de simulações de acoplamento molecular, observou-se que essas proteínas são capazes de interagir com receptores do sistema imunológico, sendo que as simulações imunes indicaram a capacidade de desencadear respostas imunológicas significativas. Embora os resultados sejam promissores, são necessários testes adicionais in vitro e in vivo para consolidar e validar essas descobertas antes de avançar para ensaios clínicos em humanos. Dessa forma, esse trabalho contribui para a compreensão e potencial combate a doenças infecciosas emergentes e reemergentes, destacando a importância da vacinologia reversa como uma abordagem ágil e promissora no desenvolvimento de vacinas.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da associação de um peptídeo imunogênico da proteína apolipoproteína n-acetiltransferase de Brucella abortus com nanopartículas de ouro sobre macrófagos : Efeito adjuvante de nanopartículas de ouro com peptídeo de Brucella abortus em macrófagos
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-08-02) Andrade, Alex Junior De; Almeida, Leonardo Augusto De; Macedo, Gilson Costa; Silva, Evandro Neves
As bactérias do gênero Brucella, um cocobacilo gram-negativo, são classificadas com base em seus hospedeiros primários, tendo a Brucella abortus como a mais distribuída globalmente e afetando principalmente a população de bovinos, causando aborto e infertilidade. Atualmente a forma de controle dessa doença é a vacinação dos animais, porém as vacinas que são comercializadas utilizam cepas atenuadas, e apesar de imunogênicas, apresentam várias desvantagens, como a prevalência de testes soropositivos em bovinos, ocorrendo incidência de virulência e contaminação acidental. Devido a isso, as vacinas de subunidades são abordagens promissoras, seguras, eficazes e com menor custo para produção. Nessa perspectiva, o presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a conjugação do peptídeo imunogênico "AIPYILESTPQALAH" de B. abortus cepa 2308 com AuNPs e caracterizar essa associação sobre macrófagos. As AuNPs foram sintetizadas, seguidas de imobilização com o 11-ácido mercaptoundecanóico (MUA) e funcionalização com a reação química de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)/Nhidroxisuccinamida (NHS). Cada etapa da síntese foi avaliada e os componentes caracterizados por FTIR, MEV-FEG, UV/VIS e DLS. Os dados indicam sucesso na associação com AuNPs@MUA e o peptídeo. A fim de entender a influência do bioconjugado, macrófagos derivados da medula óssea murina (BMDM) foram obtidos e tratados. Pelo teste de MTT foi observada uma diminuição de viabilidade celular em torno de 40%, nas amostras com AuNPs independente da bioconjugação, mostrando certo grau de toxicidade das AuNPs. Entretanto, as AuNPs foram capazes de promover um aumento de atividade metabólica dos macrófagos, havendo consumo de glicose e maior produção de lactato, houve também uma secreção de citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α, seguido de produção de óxido nítrico, indicando que a nanopartícula já é capaz de gerar um efeito adjuvante, enquanto que o bioconjugado apresentou as mesmas respostas, mas de maneira menos elevadas, indicando uma boa biocompatibilidade. Os resultados indicam um promissor bioconjugado para ser avaliado em modelos pré-clínicos para futuramente uma maior abrangência do potencial terapêutico e imunológico deste candidato vacinal.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da disbiose intestinal causada pela vancomicina durante a infecção pela bactéria Pseudomonas aeruginosa
(Universidade Federal de Alfenas, 2020-01-31) Pereira, Jéssica Assis; Almeida, Leonardo Augusto De; Santos, Hadassa Cristhina Azevedo Soares Dos; Peloso, Eduardo De Figueiredo
A Pseudomonas aeruginosa é uma das bactérias oportunistas mais comuns causadoras de infecções pulmonares em hospitais, e a vancomicina é amplamente utilizada em pacientes hospitalizados, influenciando sua microbiota intestinal. Dada a relevância da bactéria P. aeruginosa nos processos infecciosos e inflamatórios e estimulados pela necessidade de novas estratégias de tratamento, o objetivo deste trabalho foi analisar como o efeito da vancomicina sobre a microbiota intestinal murina pode favorecer ou não a infecção causada pela bactéria oportunista P. aeruginosa e como o uso do Transplante de Microbiota Fecal (TMF) pode atuar sobre essa resposta. Foi demonstrado neste trabalho que o conteúdo bacteriano fecal é alterado nos animais sob uso de vancomicina e que a disbiose intestinal acarretou na alteração do peso dos animais. Macrófagos derivados da medula óssea murina (BMDMs) estimulados com conteúdo cecal de camundongos em disbiose, apresentaram níveis mais altos de expressão de genes codificadores de citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, enquanto a expressão de IL-10 foi diminuída. Como foi confirmado que a disbiose bacteriana intestinal foi causada pela vancomicina e que essa alteração estimula diferencialmente macrófagos, foi avaliado se essa alteração da microbiota bacteriana intestinal altera a resposta do hospedeiro frente à infecção pulmonar pela bactéria oportunista P. aeruginosa. A quantidade de P. aeruginosa viável nos pulmões, baços e fígados de camundongos em disbiose mostraram níveis mais elevados, com mais danos no pulmão e ceco, além de apresentarem aumento da expressão de IL-10 e maior recrutamento de células CD11b+ no lavado bronco-alveolar. O fenótipo suscetível e dano tecidual foram revertidos quando camundongos em disbiose receberam o transplante de microbiota fecal. Em conjunto, os resultados demonstram que a vancomicina altera a microbiota intestinal, induzindo a disbiose intestinal murina, e o TMF demonstrou ser uma excelente estratégia para restaurar a comunidade microbiana intestinal e auxiliar no controle e prevenção de infecções bacterianas oportunistas de caráter nosocomial. Entretanto, embora nossos resultados possam esclarecer a relação entre os pulmões e os intestinos, é necessária uma investigação mais aprofundada para entender a resposta imunológica no interior dos pulmões, bem como a influência da disbiose intestinal neste contexto.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da expressão e do papel dos microRNAs mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p durante a infecção pulmonar causada pela bactéria Pseudomonas aeruginosa
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-04-26) Tana, Fernanda De Lima; Almeida, Leonardo Augusto De; Prudêncio, Carlos Roberto; Malaquias, Luiz Cosme Cotta
Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno humano oportunista capaz de causar severas infecções em pacientes imunodeprimidos e em pacientes que apresentam fibrose cística. Para desencadear uma resposta efetiva contra a infecção pela P. aeruginosa é necessário uma primeira linha de reconhecimento desta bactéria pelo sistema imunológico inato. Apesar do desencadeamento da resposta imune inata ser benéfica no controle da infecção pela P. aeruginosa, esta resposta deve ser controlada. Estudos recentes têm começado a esclarecer como os miRNAs desempenham papéis fundamentais na regulação de processos como infecção, resposta imune e inflamação participando da modulação da resposta imune. Dada a relevância da bactéria P. aeruginosa nos processos infecciosos em humanos e estimulados pela necessidade de desvendar os mecanismos de regulação da reposta imune contra esta bactéria, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel do mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p expressos em camundongos infectados pelas cepas ATCC 27853 e PA14 da bactéria P. aeruginosa. Para avaliar o nível de expressão dos mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p e das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-12 in vitro, o RNA total foi extraído de células Raw 264.7, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) e de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) para análise de PCR em tempo real. Após a infecção das células Raw 264.7, BMDMs e BMDCs foi possível observar que a expressão dos miRNAs e das citocinas ocorreu de forma dependente em cada tipo celular infectado. Para as análises in vivo camundongos C57BL/6 foram infectados via intratraqueal com as cepas ATCC 27853 e PA14 de P. aeruginosa para análises de UFCs, RT-qPCR, histopatologia e estereologia. Apenas a cepa PA14 foi recuperada no pulmão e baço dos animais, onde não foi observado variação na expressão do mmu-miR-155-5p nem aumento significativo de uma série de citocinas efetoras. As análises histopatológicas demostraram intenso processo inflamatório difuso apresentando número maior de células inflamatórias, diminuição no número de alvéolos e do volume da estrela quando comparados aos animais não infectados e animais infectados pela cepa avirulenta. No pulmão dos animais infectados com a cepa ATCC 27853, observou-se aumento de expressão de mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p, das citocinas inflamatórias. A identificação das redes de regulação dos miRNAs em estudo mostrou importantes alvos diretos e indiretos associados à resposta imune inata que podem estar comprometidas durante a expressão diferencial de mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p em favorecimento ou em detrimento da resolução da infecção pela P. aeruginosa. Os resultados obtidos até o momento permitem sugerir que a infecção pela P. aeruginosa exerce uma modulação na expressão de miRNAs e consequentemente na resposta imune contra esta bactéria e que a virulência de diferentes cepas de P. aeruginosa influenciam na expressão dos miRNAs mmu-miR-155-5p e mmu-miR-146b-5p, de citocinas pró-inflamatórias e na patologia. Mais estudos são necessários para desvendar os mecanismos pelos quais cepas virulentas da P. aeruginosa conseguem subverter a resposta imune e garantir a sua replicação no hospedeiro.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da imunogenicidade de epítopos da proteína estrutural spike do SARS-CoV-2 racionalmente selecionados por vacinologia reversa e associados ao BCG vacinal como carreador e indutor da imunidade inata treinada
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-10-06) Santos, Ana De Souza; Almeida, Leonardo Augusto De; Rodrigues, Marina Quádrio Raposo Branco; Novaes, Rômulo Dias
A COVID-19 está relacionada a uma síndrome respiratória aguda grave no trato respiratório inferior causada pelo SARS-CoV-2. Análises observacionais mostraram que pessoas vacinadas com o Bacilo Calmette-Guérin (BCG) têm menor probabilidade de desenvolver formas graves da COVID-19. Assim, foi hipotetizado que a associação desse bacilo com epítopos imunogênicos selecionados por técnicas de vacinologia reversa das proteínas estruturais do SARS-CoV-2 pode acarretar o desenvolvimento de uma resposta imune inata treinada capaz de aumentar a resposta imune protetora específica contra esse vírus. Assim, esse trabalho teve como objetivo identificar epítopos imunoestimulantes da proteína spike do SARS-CoV-2 e associá-los ao BCG vacinal para a estimulação de uma resposta imune inata treinada. Para isso, 53.838 genomas depositados em bancos de dados do SARS-CoV-2 foram utilizados e as putativas sequências proteicas preditas da spike do vírus foram alinhadas para a determinação de uma proteína consenso mundial. A estrutura dessa proteína foi predita por modelagem molecular e foi possível identificar dois peptídeos de maior promiscuidade de se ligar aos BCR, MCH-I e MHC-II, assim como as características quanto a estabilidade, imunogenicidade, não alergenicidade, e com propriedades físico- químicas compatíveis para o desenvolvimento de peptídeos imunogênico. Por ancoragem molecular foi possível identificar os pontos e as forças de interação com as moléculas de MHC. O epítopo 1 apresenta pontos de alterações já identificadas nas variantes do novo coronavírus, assim como um ponto de n- glicosilação. Por outro lado, o epítopo 2 não se encontra em posições de alta variabilidade nas variantes em circulação no momento, incluindo a nova variante ômicron. Duas formulações contendo o BCG e cada peptídeo foram utilizadas para estimular macrófagos derivados da medula óssea murina demonstrando um aumento expressivo na secreção de IL-6, IL-1 e TNF- quando do contato prévio com essa formulação. Ademais, a via de MAPK se mostrou mais ativada nessas células com destaque para maior ativação de p38. Análises in vivo, utilizando camundongos C57BL/6 vacinados intramuscularmente com as formulações, mostraram um aumento expressivo na produção de IgG total, IgG1 e IgG2c específicos para os peptídeos da proteína spike no soro, assim como a secreção aumentada de IFN-, IL-6, TNF-α e IL-17. Em suma, a abordagem racional de predição de epítopos imunogênicos ao serem associados ao BCG vacinal foi capaz de induzir a imunidade efetiva tanto inata quanto adaptativa em modelos in vitro e in vivo.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da resposta do hospedeiro murino frente à infecção pela bactéria oportunista pseudomonas aeruginosa em modelo de mucosite induzida pelo quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU)
(Universidade Federal de Alfenas, 2020-01-07) Santana, Aleksander Brandão; Almeida, Leonardo Augusto De; Gonçalves, Daniel Bonoto; Miranda, Tatiana De Teixeira
O tratamento de tumores malignos envolve a utilização de quimioterapia na tentativa de controlar ou combater o crescimento desordenado das células. Entretanto, diversos efeitos adversos ocorrem durante esse tratamento, sendo um exemplo, a inflamação grave das mucosas do trato gastrointestinal, conhecida como mucosite gastrointestinal, assim como infecções oportunistas com complicações potencialmente fatais. Este trabalho objetivou avaliar a resposta do hospedeiro frente à infecção pela bactéria oportunista Pseudomonas aeruginosa em modelo de mucosite induzida pelo quimioterápico 5- Fluorouracil(5-Fu). Para isso, quatro grupos experimentais constituídos de camundongos Balb/c foram utilizados: G1 – PBS/Não infectado(tampão salino-fosfato); G2 – PBS/Infectado; G3 - 5- Fu /Não infectado; G4 - 5-Fu/Infectado. Os animais receberam uma dose intraperitoneal de solução salina estéril ou de 5-Fu por 3 dias consecutivos para indução da mucosite. A administração do quimioterápico 5-Fu acarretou na perda de peso dos animais no decorrer de três dias consecutivos do tratamento, e fezes moderadamente úmidas a partir do terceiro dia quando comparados aos animais que não foram tratados com o 5-Fu. O DNA fecal dos animais foi extraído para análise dos grupos filogenéticos bacterianos. A composição da microbiota fecal dos animais sob condições de mucosite se apresentou alterada. Os animais dos grupos PBS/Infectado e 5-Fu/Infectado foram infectados intratraquealmente pela estirpe virulenta PA14 de P. aeruginosa. Dez horas após a infecção, foi observada uma maior recuperação de bactérias viáveis no pulmão, fígado e baço nos animais em condições de mucosite. As análises histopatológicas e estereológicas mostraram que os animais tratados com 5-Fu apresentaram lesões estruturais no ceco. No pulmão do grupo 5-Fu/não Infectado, os animais apresentaram discreto espessamento septal porém nos grupos PBS/infectado e 5-Fu/infectado houve intenso infiltrado inflamatório e espessamento de septos alveolares. O fígado de animais infectados apresentou intenso infiltrado inflamatório com degeneração hidrópica em hepatócitos. No grupo 5-Fu/não infectado, essas alterações se apresentaram de maneira discreta. O RNA total do pulmão e baço foi extraído para análise da expressão diferencial de TNF-a(Fator de necrose tumoral alpha) e iNOS(Óxico nítrico sintetase). Uma maior expressão dos genes TNF-a e de iNOS foi observada no baço dos animais infectados sob condições de mucosite. A expressão de iNOS se mostrou aumentada nos pulmões do grupo 5- Fu/Infectado. Os resultados sugerem que a administração do quimioterápico 5-Fu em modelo murino o torna mais suscetível à infecção pulmonar pela bactéria oportunista P. aeruginosa.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da resposta imune inata após infecção pelo zika virus em macrófagos previamente infectados com dengue virus
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-02-11) Brancaglion, Gustavo Andrade; Almeida, Leonardo Augusto De; Prudêncio, Carlos Roberto; Ikegaki, Masaharu
O Dengue virus (DENV) é um vírus de RNA da família Flaviviridae compreendendo quatro sorotipos relacionados, mas antigenicamente distintos. A dengue é a principal doença viral transmitida por artrópodes no mundo e representa um importante problema de saúde humana global, especialmente no Brasil onde em 2016 também foi registrado o maior surto de infecção pelo Zika virus (ZIKV), outro flavivírus com características genômicas e estruturais semelhantes ao DENV. A co-circulação de DENV e ZIKV é realidade no Brasil fornecendo evidências, inclusive, da existência de uma co-infecção. A resposta imune inicial contra ZIKV e DENV em células é mediado pelos receptores da imunidade inata que ativam sinalizações para expressão de genes antivirais ou pró-inflamatórios. Dessa forma, o presente estudo tem por finalidade uma melhor compreensão da resposta imune inata frente à infecção pelo ZIKV em macrófagos previamente infectados pelo DENV. Para isso, células da medula óssea de camundongos C57BL/6 foram diferenciadas em macrófagos (BMDM) e confirmadas por citometria de fluxo, cujo resultado demonstrou que mais de 95% das células diferenciadas eram CD11b+. Os BMDMs foram infectados independentemente com os quatro sorotipos de DENV (MOI 1:1) e após 12 horas essas células foram infectadas com o ZIKV (MOI 0.1:1). Ao final de mais 12 horas, as células foram analisadas quanto à expressão dos marcadores de ativação de macrófagos, CD80 e CD86, por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. A expressão diferencial de genes pró-inflamatórios e anti-viral foi realizada por qPCR. A expressão de IFN- foi diminuída em todos os grupos analisados. Não houve diferença na expressão dos marcadores CD80/CD86 nos BMDMs previamente infectados com DENV seguidos da infecção pelo ZIKV, exceto para o sorotipo 4, foi possível observar um aumento expressivo de ambos marcadores. Contudo, a expressão diferencial tanto de TNF- quanto IL-1 foi drasticamente reduzida nesse grupo. Com essa diminuição observou-se o aumento da viabilidade celular frente à diminuição na produção da citocina TNF-α. Análises de bioinformática indicaram um possível controle da expressão de TNF- e IL-1 pelo mmu-miR-181a-5p, que é induzido pela ativação da via de NF-B. Para isso, a expressão desse microRNA será avaliada com o objetivo de entender melhor a relação entre ativação de BMDMs pelos marcadores de superfície CD80/CD86 juntamente com a modulação da ativação de TNF- e IL-1 no modelo de infecção pelo DENV4 seguido da infecção do ZIKV.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação do papel da interleucina-10 endógena na infecção pela bactéria Pseudomonas aeruginosa em modelo murino
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-06-22) Belo, Valéria Aparecida; Almeida, Leonardo Augusto De; Macedo, Gilson Costa; Coelho, Luiz Felipe Leomil
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, considerada como patógeno oportunista humano, causando infecções agudas potencialmente letais, sendo de grande importância clínica. A resposta imune inata ocorre através do reconhecimento do patógeno seguida de uma intensa resposta inflamatória que auxilia na eliminação da bactéria. Contudo, essa resposta deve ser controlada, sendo a IL-10 considerada como uma citocina imunorreguladora que inibe a produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias, e as metaloproteinases (MMPs) também importantes reguladores da resposta imune e estão associadas a diversos processos fisiológicos e patológicos. Dada a importância dos mecanismos imunológicos para o melhor entendimento da patofisiologia da infecção por P. aeruginosa, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da IL-10 murina endógena na infecção pela cepa virulenta PA14 de P. aeruginosa. Para avaliar o papel da IL-10, foi realizada a infecção intratraqueal com a cepa PA14 virulenta em camundongos C57BL/6 ou IL-10 KO. Dez horas após a infecção foi analisada a contagem de unidades formadoras de colônias (UFCs), análises histopatológicas, estereológicas, zimografia e PCR em tempo real nos pulmões dos animais. As análises in vivo demonstraram que a cepa PA14 foi recuperada em ambos os tipos de animais, no qual os camundongos IL-10 KO apresentaram elevado número de bactérias viáveis no órgão quando comparado ao grupo C57BL/6. As análises histopatológicas e estereológicas mostraram que os camundongos IL-10 KO apresentaram espessamento de septos alveolares, uma inflamação difusa intensa com elevada concentração de infiltrado de células inflamatórias e alvéolos colapsados culminando na diminuição do espaço alveolar e da superfície pulmonar quando comparados aos animais controles. A atividade da MMP-9, mas não da MMP-2, foi aumentada nos animais infectados, sendo mais ativa nos animais IL-10 KO, assim como o aumento da expressão diferencial dos genes IL-6 e TNF-α. Este trabalho apresenta de forma inédita a estreita relação entre o controle da infecção por P. aeruginosa pela IL-10 endógena e o seu controle sobre a MMP-9 e os processos histopatológicos do processo infeccioso em questão.
Acesso aberto (Open Access)
Ensaios clínicos de fármacos no tratamento de Covid-19 e prediçãode um epítopo racionalmente selecionado da proteína do envelope viral
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-06-16) Scodeler, Gislaine Cristina; Almeida, Leonardo Augusto De; Dias, Amanda Latercia Tranches; Carlos-Bender, Jaqueline
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), no primeiro mês de 2022 havia cerca de 300 milhões de casos confirmados de COVID-19, doença respiratória causada pelo vírus SARS-CoV-2 que ocasionou mais de 5.900.000 mortes em todo o mundo. Uma pandemia foi declarada pela OMS em março de 2020, quando o novo coronavírus se espalhou pelo mundo e novas variantes vêm dificultando o controle das infeções. O curto espaço de tempo entre os primeiros casos em Wuhan e a declaração de uma pandemia iniciou a busca por maneiras de impedir a disseminação do SARS-CoV-2 ou de tentar curar a doença COVID-19. Mais do que nunca, grupos de pesquisa estão desenvolvendo vacinas, fármacos e compostos imunobiológicos, também estão tentando reposicionar fármacos já existentes em um número crescente de testes clínicos. Há grandes expectativas em relação à profilaxia por meio das vacinas ao redor do mundo que já se mostram eficazes para a prevenção do COVID- 19. No entanto, produzir doses suficientes de vacinas, disponibilidade igualitária para toda a população mundial e o surgimento de novas variantes do SARS-CoV-2 são desafios cada vez mais observados. Apesar disso, esforços têm sido feitos para criar diferentes vacinas com diferentes abordagens para que possam ser utilizadas por toda a população. Neste trabalho, resumimos 3.743 ensaios clínicos em diferentes fases, mostrando um maior número de ensaios clínicos baseados em estudos de desenvolvimento ou reposicionamento de fármacos na Europa e nos EUA e ensaios clínicos em menor número em países de baixa renda. Resultados promissores sobre o reposicionamento e desenvolvimento de novos fármacos, anticorpos monoclonais, plasma convalescente e células-tronco mesenquimais para controle da infecção/replicação viral ou da resposta hiperinflamatória do hospedeiro frente ao novo coronavírus trazendo esperança para o tratamento da doença. Nesse contexto, as proteínas estruturais do novo coronavírus, como a proteína do envelope viral (E), se mostram promissoras como alvos moleculares específicos na busca por fármacos ou até mesmo de identificação de imunoestimulantes. Assim, nesse trabalho também objetivamos identificar epítopos imunoestimulantes na proteína do envelope do SARS-CoV-2. Utilizando o banco de dados NCBI SARS-CoV-2 Resources, 53.838 genomas depositados do novo coronavírus foram utilizados para identificação do gene codificador da proteína E seguido da tradução in silico e sobreposição das sequências dos 75 aminoácidos dessa proteína para identificação de uma proteína E consenso mundial. Essa sequência foi utilizada para a identificação por modelagem molecular da estrutura tridimensional e para análises in silico de identificação de potenciais epítopos imunoestimulatórios capazes de serem apresentados via MHC-I ou MHC-II ou serem reconhecidos pelos BCRs, e dos parâmetros físico-químicos e de docking molecular com as moléculas de MHC, um epítopo linear promissor da proteína E foi identificado: LVKPSFYVYSRVKNLNS. Ensaios in vitro e in vivo devem ser realizados para a confirmação dos resultados obtidos in silico para que esse peptídeo possa ser potencialmente utilizado como um componente vacinal ou até mesmo como alvo molecular para diagnóstico da presença da infeção causada pelo SARS-CoV-2.
Acesso aberto (Open Access)
Epitope-based vaccine of a Brucella abortus putative small RNA target induces protection and less tissue damage in mice
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-09-23) Oliveira, Karen Cristina; Almeida, Leonardo Augusto De; Macedo, Gilson Costa; Colombo, Fábio Antônio
Brucella abortus é uma bactéria intracelular Gram-negativa que causa uma doença zoonótica chamada brucelose. Emboras as vacinas atualmente disponíveis para a imunização animal possuam potencial imunogênico, essas ainda apresentam muitas desvantagens, causando abortos de grande proporção em fêmeas prenhas e febre ondulante em humanos. Neste contexto, a recente tendência no projeto de novas vacinas contra brucelose, têm se baseado na estratégia de predição de epítopos imunogênicos selecionados por vacinologia reversa. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi identificar e avaliar a imunogenecidade de um epítopo vacinal alvo de putativos pequenos RNAs de B. abortus mediante a infecção desta bactéria em modelo murino. Foi demonstrado nesse trabalho que pequenos RNAs de B. abortus são expressos durante a infecção precoce de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs), sendo identificado uma apolipoproteína N-aciltransferase (Int) como o putativo alvo de maior expressão dos pequenos RNAs. Visto que a apoliproteína N-aciltransferase apresenta diminuição da sua expressão em modelo de BMDMs infectados, um epítopo desta proteína foi racionalmente selecionado por imunoinformática e explorado como candidato a vacinação contra brucelose. Camundongos C57BL/6 imunizados e desafiados com B. abortus mostraram menor recuperação no número de bactérias viáveis no fígado, baço e linfonodo axilar quando comparados a camundongos não vacinados. Os camundongos vacinados e infectados apresentaram aumento na expressão de TNF-α , IFN-γ e IL-6, seguido do também aumento na expressão dos genes anti-inflamatórios IL-10 e TGF-β no fígado, justificando a redução no número e tamanho dos granulomas observados. BMDMs estimulados com sobrenadante de esplenócitos de camundongos vacinados e infectados apresentaram marcação para CD86+ mais intensa que os demais estímulos, além de expressarem maior quantidade de iNOS e consequente aumento na produção de NO, sugerindo aumento na capacidade fagocítica e microbicida dessas células em eliminar a bactéria. Em conjunto, os resultados demonstraram que o peptídeo vacinal foi capaz de estimular uma resposta imune protetora em organismos infectados com características sugestivas de predominência do perfil Th1.
Acesso aberto (Open Access)
Heat-killed Pseudomonas aeruginosa drives M1 polarization on BCG- primed macrophages
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-02-06) Rosa, Caio Pupin; Almeida, Leonardo Augusto De; Tana, Fernanda De Lima; Peloso, Eduardo De Figueiredo
A imunidade inata treinada é conceito recente que diz respeito ao treinamento de macrófagos, células natural killer (NK), células dendríticas e células epiteliais frente à estimulação heteróloga, levando ao treinamento ou à tolerância de resposta. Considerando os recentes indícios de treinamento em modelos de estudo de pneumonias e as possíveis implicações na prevenção e no tratamento dessas afecções, o presente trabalho se propôs a avaliar o perfil de resposta de macrófagos estimulados previamente pelo Bacilo de Calmatte-Guérin (BCG) e/ou Pseudomonas aeruginosa morta pelo calor (HKPa) seguido de estímulos homólogos ou heterólogos. Para isso, macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57BL/6 foram obtidos e estimulados com BCG e/ou HKPa. Houve ativação de macrófagos CD11b+ pelo aumento da imunofluorescência emitida por CD80/86, quando de estimulação homóloga ou heteróloga com BCG e/ou HKPa. As mesmas células demonstraram tendência pró- oxidante pelos testes da NADPH-oxidase, TBARS e TRAP, quando do estímulo com BCG e aumento da secreção de óxido nítrico quando da estimulação heteróloga iniciada com BCG. Ainda, houve aumento da secreção de IL-6 quando da estimulação heteróloga iniciada por BCG. Contudo, a estimulação homóloga com HKPa aumentou tanto a expressão quanto a secreção de IL-10. Portanto, o presente trabalho sugere o priming de macrófagos pelo BCG, quando da estimulação heteróloga com HKPa, e sugere tolerância induzida pela estimulação homóloga de HKPa.
Acesso aberto (Open Access)
Ivermectin-induced bacterial gut dysbiosis does not increase susceptibility to Pseudomonas aeruginosa lung infection.
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-06-03) Belo, Thiago Caetano Andrade; Almeida, Leonardo Augusto De; Santiago, Andrezza Fernanda; Reis, Bruno Luiz Fonseca Schamber
A manutenção da microbiota intestinal é essencial para o equilíbrio fisiológico, metabólico e imunitário, além de influenciar no estado saúde-doença. Alguns estudos sugeriram a utilização da ivermectina para o tratamento da Covid-19 e mesmo sendo posteriormente refutada por estudos e rejeitado por agências de controle de medicamentos em todo o mundo, o seu uso permaneceu e foi incentivado por diversos segmentos do governo e saúde. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do uso oral de ivermectina sobre a microbiota bacteriana intestinal e quais são os efeitos desta disbiose frente a pneumonia oportunista causada por Pseudomonas aeruginosa em modelo murino. Para isso, camundongos C57BL/6 foram submetidos ao tratamento consecutivo com PBS ou ivermectina por gavagem. Não houveram diferenças significativas no peso dos animais e da ração consumida durante o período experimental. Porém, observou-se o aumento da umidade e consistência disforme das fezes do grupo tratado com ivermectina. Através de análise metagenômica do DNA total das fezes, foi observada a diminuição dos filos Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria e Tenericutes e o aumento do filo Verrucomicrobia nos animais tratados com ivermectina, em comparação ao grupo PBS. Ademais, o conteúdo cecal dos animais tratados com ivermectina apresentou ser mais imunoestimulatório em macrófagos derivados da medula óssea murina pelo aumento de marcação da molécula CD86 na membrana dessas células quando analisados por imunofluorescência, além do aumento na secreção de IL-6 e diminuição de IL-10, quantificado por ELISA. A organização histopatológica cecal dos animais tratados com ivermectina apresentou-se alterado, além do tratamento com ivermectina induzir danos no tecido hepático e aumentar a expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias no fígado. Ao serem desafiados com P. aeruginosa, não houve susceptibilidade aumentada à infecção nos animais disbióticos, apresentando semelhança entre os grupos tratados com PBS ou ivermectina e infectados na recuperação de bactérias viáveis no pulmão, fígado, baço e rim, análises histopatológicas e expressão de citocinas no pulmão ou secreção de citocinas pró ou anti-inflamatórias de esplenócitos cultivados de animais infectados e reestimulados com P. aeruginosa. Foi observado uma extensão nos danos hepáticos e aumento na expressão de citocinas pró e anti- inflamatórias em grupos tratados com ivermectina e desafiados com P. aeruginosa. É possível concluir que o uso contínuo de ivermectina não acarretou maior suscetibilidade ou resistência à P. aeruginosa, apesar do efeito desse fármaco sobre a microbiota intestinal dos animais tratados.

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