Mestrado em Ciências Farmacêuticas

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Navegando Mestrado em Ciências Farmacêuticas por Orientador(a) "Ariosa, Marília Caixeta Franco"

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Caracterização de isolados de Candida spp de cavidade bucal quanto aos aspectos fenótípicos e moleculares e obtenção de mutantes heteroresistentes à antotericina B e fluconazol
    (Universidade Federal de Alfenas, 2007-07-13) Claudino, André Luís Ribeiro; Ariosa, Marília Caixeta Franco; Giannini, Maria José Soares Mendes; Melhem, Márcia De Souza Carvalho
    Nos últimos anos o aumento na incidência de candidose superficial e invasiva causada por espécies emergentes resistentes tem sido atribuído a disseminação do uso de antibióticos e agentes imunossupressores. O aumento de Candida não-albicans deve-se ao incremento de pacientes imunodeprimidos, neutropênicos, recém nascidos de baixo peso, procedimentos invasivos e iatrogenia. Todos esses fatores permitem que agentes pouco virulentos, causem doenças. Vários estudos bioquímicos e moleculares foram realizados no sentido de elucidar as causas da resistência a antifúngicos em leveduras. Os objetivos do presente estudo foram: estudar leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal de pacientes com e sem HIV; comparação de métodos de identificação dos isolados; determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos anfotericina B e fluconazol pelas metodologias de microdiluição CLSI, AFSTEUCAST e difusão em agar Etest e obter amostras heterorresistentes à anfotericina B e ao fluconazol por indução e seleção. Foram identificados 22 isolados de C. albicans, 3 de C. tropicalis, 3 de C. parapsilosis e 2 de C. glabrata segundo o método clássico. A identificação por métodos morfológicos e bioquímicos foi 100% concordante com o método molecular (PCR), tanto pela amplificação dos primers espécies-específicos (C. albicans e C. dubliniensis) quanto pela comparação do tamanho do fragmento amplificado pelos primers da região ITS2. A correlação entre a metodologia Etest e os dois métodos de microdiluição foi alta. Todas as amostras selvagens foram sensíveis a anfotericina B (CIM£2,0μg/mL) e apenas um isolado (3,33%) de C. tropicalis foi resistente ao fluconazol (CIM³64,0μg/mL por CLSI e CIM³64,0μg/mL por AFST-EUCAST). Foram selecionadas amostras heteroresistentes através da pressão seletiva utilizando meio adicionado de fluconazol (8μg/mL) e em seguida com anfotericina B (1,0μg/mL). A pressão seletiva também foi feita iniciando-se com anfotericina B e em seguida fluconazol. Paralelamente, as amostras selvagens foram submetidas à indução de resistência através do cultivo primeiro em concentrações crescentes de fluconazol (16,0; 32,0; 64,0; 128 e 256mg/mL) e em seguida com anfotericina B (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0mg/mL). Os testes também foram feitos invertendo-se os antifúngicos, iniciando com anfotericina B e depois fluconazol. Foram obtidas três amostras heterorresistentes a fluconazol, das quais duas foram por indução (C. glabrata e C. tropicalis) e uma por seleção (C. tropicalis.). Ambas amostras de C. tropicalis foram originadas de um mesmo isolado selvagem. Nenhuma amostra mudou seu perfil de sensibilidade para anfotericina B, apesar de alguns isolados apresentarem capacidade de crescimento em várias concentrações deste antifúngico (1,0 a 3,0μg/mL). Após cultivos sucessivos em meio livre de droga, somente a cepa obtida por seleção manteve seu fenótipo de resistência. As cepas selvagens e suas mutantes apresentaram o mesmo perfil quando comparadas pela amplificação da região ITS2. Conclui-se que, embora a maior parte das espécies estudadas seja C. albicans (73,33%) todas as amostras heteroresistentes ao fluconazol obtidas foram Candida nãoalbicans (10%). As duas cepas mutantes obtidas pelo mesmo isolado inicial possuem, possivelmente, mecanismos múltiplos e distintos de resistência que, associado ao isolado, conferem resistência e/ou adaptabilidade à levedura frente ao antifúngico.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Leishmaniose tegumentar americana: análise epidemiológica de pacientes de diferentes regiões de Minas Gerais e caracterização molecular do gênero Leishmania
    (Universidade Federal de Alfenas, 2007-10-16) Peloso, Eduardo De Figueiredo; Ariosa, Marília Caixeta Franco; Silva, Eduardo Sérgio Da; Silva, Paulo Márcio De Faria E
    A leishmaniose tegumentar americana (LTA), uma das formas clínicas das leishmanioses, está em expansão no Brasil e representa importante causa de morbidade para populações residentes em áreas endêmicas. Avaliações do perfil epidemiológico, dos serviços de diagnóstico e tratamento são necessárias para o estabelecimento de estratégias de controle da doença, assim como o emprego de novas ferramentas laboratoriais, como a PCR. Neste trabalho foram avaliados os aspectos epidemiológicos, de diagnóstico e tratamento de pacientes com LTA de diferentes regiões de Minas Gerais, além do uso de diferentes técnicas de extração de DNA e de iniciadores na PCR para a identificação e diferenciação do agente etiológico. Adicionalmente, foi comparada a positividade dos iniciadores dirigidos para a região conservada (150/152) e variável (13Y/13Z) do minicírculo do kDNA de Leishmania em amostras biológicas de pacientes sugestivos para LTA. Foi realizado levantamento epidemiológico, de diagnóstico e tratamento de 824 pacientes portadores de LTA, sendo 261 da região sul e sudoeste do estado de Minas Gerais (SSMG) e 563 do Vale do Rio Doce (VRD). Os dados foram obtidos através das fichas de notificação das Gerências Regionais de Saúde (GRS) do SSMG e do ambulatório de Leishmanioses “Dr. Paulo Araújo Magalhães” de Caratinga (VRD) entre 2002 e 2006. Trinta e nove pacientes com lesões sugestivas para LTA, provenientes destas regiões foram submetidos a exames laboratoriais, além da PCR. As amostras de DNA foram extraídas por aquecimento, pela técnica do fenol/clorofórmio, proteinase K e kit Wizard, e posteriormente usadas na PCR e PCR-RFLP. No período analisado, foi observada diminuição de 59,7% dos casos de LTA no SSMG e de até 25,7% no VRD. A forma clínica cutânea foi a predominante, com 91,9 e 93,6% no SSMG e VRD respectivamente. No SSMG, a maioria dos pacientes (51,7%) tem residência urbana, enquanto que no VRD a rural foi predominante (95,7%). No SSMG houve positividade em 55,6, 10,7 e 19,5% dos casos de LTA no Teste de Montenegro (TM), nos exames parasitológico e histopatológico, respectivamente. No VRD a positividade dos casos de LTA foi de 84,0 no TM e 73,0% no exame parasitológico. A alta por cura com a medicação empregada variou de 71,8 a 92,0% no SSMG e chegou a 78,0% no VRD. Dos 39 pacientes sugestivos, 32 foram confirmados para LTA. As extrações permitiram observar que mesmo a partir de DNA total degradado foi possível detectar kDNA de Leishmania. Nas amostras sugestivas, a positividade com 13Y/13Z e 150/152 foi de 56,4 e 76,9% respectivamente. Nos pacientes confirmados para LTA, a positividade com 13Y/13Z foi de 68,7% e com 150/152 foi de 93,7%. O emprego dos iniciadores 150/152 foi mais viável, o que não descarta o uso de 13Y/13Z, dada a expressiva positividade alcançada em amostras que requerem extração simplificada de DNA e com baixo custo. A PCR-RFLP possibilitou a identificação de L. (V.) braziliensis nas amostras biológicas dos pacientes com LTA. Os dados do presente trabalho também reforçam a necessidade de ações que estabeleçam um centro de referência no diagnóstico e tratamento da LTA no SSMG.
    The american tegumentary leishmaniasis, (ATL), one of clinic forms of leishmaniasis, is in expansion in Brazil and represent important cause of morbidity for populations who live in endemic areas. Profile epidemiological studies, health services and treatment are needs to establish strategies of disease control, as well as to employ new tools laboratorials, like PCR ones. This research evaluated the epidemiological aspects, diagnoses and treatment from patients with ATL from different regions Minas Gerais, beyond to use varied extraction techniques DNA and different primers in PCR to make possible the identification and differentiation of the etiological agents. Additionally, it compared the positivity of the primers addressed to the conserved (150/152) and variable (13Y/13Z) region of the Leishmania kDNA minicircle in biological samples of patients suggestive to ATL. It was to carried out epidemiological studies, diagnoses and treatment of 824 patients with ATL, being 261 from Southern and Southwestern regions of Minas Gerais state (SSMG) and 563 from river Doce valley (VRD). The data were obtained from notification files Regional Health Authorities – RHA of SSMG and from Leishmaniasis ambulatory “Dr. Paulo Araújo Magalhães” at Caratinga city (VRD) between 2002 and 2006. Thirty nine patients from these regions and with suggestive ATL lesions were submitted to laboratorial exams, beyond of the PCR. The DNA samples extracted by heating, phenol/ chloroform technique, proteinase K and by Wizard kit, and later used in the PCR and PCR-RFLP. In the period analyzed, it was observed decrease of 59.7% of ATL cases in SSMG and of up to 25.7% in VRD. The cutaneous clinic form was predominant with 91.9 and 93.6% in SSMG and VRD respectively. The greatest part of the patients from SSMG has urban residence (51.7%) while in VRD the rural was predominant (95.7%). In the SSMG there was positivity in 55.6, 10.7 and 19.5% of ATL cases in the Montenegro test (MT), parasitological and histopatological exams, respectively. In the VRD the positivity was 84.0 in the MT and 73.0% in the parasitological exam. Discharge from the treatment due to cure varied of 71.8 to 92.0% in the SSMG and reached 78.0% in VRD. From the 39 suggestive patients, 32 were confirmed to ATL. The DNA extractions allowed observing that even starting from total degraded DNA was possible to detect kDNA of Leishmania. In the suggestive samples, the positivity of DNA with 13Y/13Z and 150/152 was about 56.4 and 76.9% respectively. In the confirmed patients to ATL, the positivity to 13Y/13Z was about 68.7% and to 150/152 was of 93.7%. The employment of the primers 150/152 was viable, what doesn't discard the use of 13Y/13Z, given the expressive positivity reached in samples that request simplified extraction of DNA and with low cost. PCR-RFLP made possible the identification of L. (V.) braziliensis in the patients' biological samples with LTA. The data of the present work they also reinforce the need of actions that establish a reference center in the diagnosis and treatment of LTA in SSMG.