Mestrado em Ciências Farmacêuticas

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Navegando Mestrado em Ciências Farmacêuticas por Orientador(a) "Dias, Amanda Latercia Tranches"

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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Análise da expressão gênica diferencial de aspartato proteases secretadas (SAP2 e SAP4) por Candida albicans exposta a concentrações subinibitórias de antifúngicos e contato com macrófagos
    (Universidade Federal de Alfenas, 2016-02-26) Oliver, Josidel Conceição; Dias, Amanda Latercia Tranches; Silva, Eriques Gonçalves Da; Padovan, Ana Carolina Barbosa
    As infecções fúngicas se tornaram um grande problema de saúde pública, especialmente em ambientes hospitalares. Candida spp. são os principais patógenos em infecções fúngicas invasivas. A produção de aspartato proteases secretadas (Sapp) por Candida spp. pode estar relacionado com o aumento do número de infecções e resistência aos medicamentos. A produção de proteases é codificada por uma família de 10 genes SAP1-10, sendo SAP2 o gene mais comumente expresso em Candida albicans. A expressão de SAP4 está associada à produção de enzimas Sap4p e formação de hifas que podem contribuir para a invasão dos tecidos hospedeiros e destruição de macrófagos em processos infecciosos. Este trabalho avaliou a expressão dos genes SAP2 e SAP4 em C. albicans ATCC 10231 cultivadas na presença ou ausência de macrófagos e expostas a concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Candida albicans foi cultivada em ágar Sabouraud Dextrose a 37ºC por 24 h, e posteriormente em caldo carbono levedura base enriquecido com soro-albumina bovina (YCB-BSA), e na ausência ou presença de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. A linhagem celular monocítica humana de origem leucemia (THP-1) foi cultivada em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 μg/ml) a 37ºC, sob atmosfera de 5% de CO2 durante 10 dias. Para a indução da diferenciação das células, 106 monócitos foram cultivados em meio RPMI-1640 suplementado e forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) 100 nM durante 48 h. Foram utilizadas amostras de 5x106 C. albicans cultivadas na presença ou ausência de 106 macrófagos e expostas ou não a concentrações subinibitórias de antifúngicos. A amostras foram cultivadas em placas de cultura celular com 6 poços por 1 h a 37 °C, sob atmosfera de 5% de CO2. O RNA total foi extraído das amostras utilizando o reagente TRIzol®, após a purificação do RNA com DNase I, este foi convertido em cDNA, e, em seguida, a quantificação do gene SAP4 foi realizada por Reação em Cadeia de Polimerase quantitativa (qPCR) utilizando ACT1 como gene normalizador. Candida albicans cultivada na presença de macrófagos apresentou regulação positiva na expressão de SAP2 e SAP4 (p < 0,01), respectivamente, na ordem de 4,83 e 10,34 vezes maior se comparada com amostras da levedura cultivada sem contato com macrófagos. E ainda, a exposição de C. albicans a concentrações subinibitórias de fluconazol aumentou a expressão de SAP2 e diminuiu a expressão de SAP4, já a exposição da levedura a concentrações subinibitórias de anfotericina B diminuiu a expressão de SAP2 e SAP4. Os genes SAP2 e SAP4 são relacionados como fatores de virulência de C. albicans e sua expressão pode ser regulada pelo contato com fagócitos ou exposição a antifúngicos. Portanto, compreender a expressão desses genes na patogênese fúngica pode ajudar na pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos para o tratamento da candidíase, contribuindo assim para a redução da incidência de morbidade e mortalidade associada a infecções fúngicas.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Análise de aspartato protease (sap) como fator associado à virulência de linhagens de Candida albicans e Candida não-albicans
    (Universidade Federal de Alfenas, 2013-02-15) Silva, Naiara Chaves; Dias, Amanda Latercia Tranches; Silva, Eriques Gonçalves Da; Ariosa, Marília Caixeta Franco
    Candida spp. se tornaram, nas últimas décadas, importantes agentes causadores de infecções invasivas, responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade. Acredita-se que a aspartato protease secretada (Sap) seja um fator diretamente associado aos processos infecciosos exercendo papel determinante na patogenicidade de Candida spp. e que a exposição a concentrações subinibitórias de antifúngicos, pode aumentar a produção de Sap e selecionar isolados resistentes. Analisaram-se isolados de Candida albicans e Candida não-albicans oriundos de casos de infecção hospitalar. Avaliou-se o perfil proteico destes isolados por eletroforese SDS-PAGE. Avaliou-se, também, o perfil de sensibilidade dos isolados frente a antifúngicos de uso convencional em esquemas terapêuticos (fluconazol e anfotericina B) e a antifúngicos mais novos que ainda não fazem parte das rotinas hospitalares (voriconazol e caspofungina). Determinou-se a atividade proteolítica qualitativa e quantitativa de Sap e atividade metabólica de C. albicans e Candida não-albicans cultivados na presença e ausência de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Estabeleceu-se a correlação entre os testes e por fim, avaliou-se a expressão do gene SAP2 em C. albicans ATCC 64548 e C. krusei ATCC 6258. 100% dos isolados foram sensíveis a anfotericina B, voriconazol e caspofungina e 89,9% a fluconazol. Dois isolados (7,4%) apresentaram sensibilidade dependente da dose e um (3,7%) apresentou resistência ao fluconazol. Na análise qualitativa da atividade proteolítica, 77,7% dos isolados apresentaram atividade. A maioria dos isolados de C. albicans (50%) e Candida não-albicans (32%) apresentou atividade proteolítica moderada. A adição de fluconazol ao cultivo não promoveu alterações significativas na atividade proteolítica dos isolados padrões, enquanto anfotericina B inibiu o crescimento de C. glabrata ATCC 90030 e C. krusei ATCC 6258. Na análise quantitativa, todos os isolados se apresentaram ativos, sendo que a maior atividade foi observada em Candida complexo “psilosis” 210 (100%) e a menor em C. albicans 257 (2,44%). A maioria dos isolados de C. albicans (50%) foi classificada como fracamente proteolítica, enquanto Candida não-albicans (53%) como moderadamente proteolítica. A presença de antifúngicos no cultivo alterou significativamente o percentual de degradação da maioria dos isolados. A maior diferença de percentual foi observada em C. lusitaniae 286, que na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B aumentou 13,7x em relação à ausência do fármaco. O método quantitativo de determinação da atividade proteolítica apresentou maior sensibilidade. 63% dos isolados de C. albicans apresentaram alta atividade metabólica e 68% de Candida não-albicans, atividade moderada. A maior atividade metabólica foi observada em C. albicans 120 (61,72%) e a menor em C krusei ATCC 6258 (2,35%). A atividade metabólica da maioria dos isolados foi significativamente alterada. A maior diferença de percentual foi observada em Candida complexo “psilosis” 210, que na presença de ½ da IC50 de fluconazol apresentou redução de 8x na atividade metabólica em relação à ausência do fármaco. Houve expressão de SAP2 apenas em C. albicans ATCC 64548, que foi reduzida significativamente na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B. A atividade de Sap pode ser considerada um fator potencial associado à virulência, uma vez que o isolado que apresentou a maior atividade apresentou sensibilidade antifúngica reduzida.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Avaliação da atividade antimicrobiana de extratos vegetais de plantas encontradas no cerrados do sul de minas gerais
    (Universidade Federal de Alfenas, 2013-02-15) Chavasco, Juliana Moscardini; Dias, Amanda Latercia Tranches; Avelino, Cassia Carneiro; Silva, Eriques Gonçalves Da
    O uso indiscriminado de antimicrobianos pode estar associado ao fenômeno da resistência microbiana, levando ao insucesso no tratamento das infecções e impulsionando a busca por novas alternativas terapêuticas, dentre elas, os bioativos obtidos a partir de fontes vegetais. Foi avaliada a atividade antimicrobiana de extratos hidroetanólicos de plantas sobre bactérias Gram positiva, Gram negativa, leveduras, Mycobacterium tuberculosis H37 e Mycobacterium bovis pela técnica de difusão em agar e microdiluição em caldo. Dentre os extratos avaliados pelo método de difusão em agar, o extrato de Bidens pilosa folha apresentou a mais expressiva média de halos de inibição de crescimento frente aos microrganismos utilizados, seguido por Bidens pilosa flor, E. pyriformis folha, M. cauliflora folha e E. pyriformis semente que apresentaram estatisticamente a mesma média de formação de halos inibitórios sobre bactérias Gram positivas, Gram negativas e leveduras. Os extratos de Heliconia rostrata não apresentaram atividade. Mycobacterium tuberculosis H37 e Mycobacterium bovis mostraram-se resistentes a todos os extratos. Dos microrganismos avaliados, as bactérias Gram positivas M. luteus e S. aureus apresentaram o mesmo perfil de sensibilidade (p>0.05). As bactérias Gram negativas E. coli, E. cloacae, S. marcescens e P. aeruginosa também apresentaram o mesmo perfil de sensibilidade frente aos extratos (p>0.05). O perfil de senbilidade dos fungos C. albicans e S. cerevisiae foram comparáveis entre si e entre as bactérias Gram positivas B. subtilis, E. faecalis e Gram negativa S. typhimurium (p>0.05). Os extratos que apresentaram ação inibitória através do ensaio de microdiluição em caldo foram os mesmos extratos ativos no teste de difusão em agar. A avaliação da citotoxicidade foi realizada sobre células C6-36 de larvas de mosquito Aedes albopictus. Os extratos de caule e flor de Heliconia rostrata, folha e caule de Plinia cauliflora, semente de Anonna crassiflora e caule, flor e raiz de Bidens pilosa não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os maiores índices de seletividade foram apresentados pelos extratos de A. crassiflora caule e B. pilosa flor para S. aureus, apresentando potencial para estudos como futuros candidatos a fármacos. Dos microrganismos avaliados, as bactérias Gram positivas M. luteus e S. aureus apresentaram o mesmo perfil de sensibilidade (p>0.05). Dos microrganismos que apresentaram alguma sensibilidade a qualquer um dos extratos, M. bovis, P. aeruginosa, S. marcescens, E. cloacae e E. coli foram estatisticamente, igualmente os menos sensíveis. Apenas os extratos de B. pilosa folha apresentou igualdade, estatisticamente significativa, da média de efetividade inibitória quando comparado ao controle positivo, a clorexidina
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Biofilmes e suspensões celulares de Candida spp. isoladas de ambiente hospitalar: efeitos de antifúngicos sintéticos e bioativos vegetais
    (Universidade Federal de Alfenas, 2013-03-22) Carvalho, Roberta Ribeiro De; Dias, Amanda Latercia Tranches; Coelho, Luiz Felipe Leomil; Melhem, Márcia De Souza Carvalho
    Infecções fúngicas invasivas estão associadas a altos índices de morbidade e mortalidade, sendo causadas principalmente por leveduras do gênero Candida. A formação de biofilmes tem sido considerada um dos principais fatores associados à virulência destas leveduras, devido, principalmente, à maior resistência às terapias antimicrobianas apresentada pelas células sésseis em comparação às células planctônicas. Torna-se necessária a seleção de antifúngicos eficazes na terapêutica das infecções associadas a biofilme. O presente estudo tem por objetivo avaliar e comparar o efeito de antifúngicos sintéticos (Fluconazol e Anfotericina B) e bioativos vegetais (Guttiferona A e 7-Epiclusianona) em biofilmes e suspensões celulares de Candida spp. isoladas de ambiente hospitalar. Foram coletadas 180 amostras, havendo uma frequência de distribuição de 17,8% de isolados de Candida spp., provenientes principalmente das mãos de profissionais (28% das amostras), locais de preparo e armazenamento de medicamentos (16%) e leitos de pacientes (16%). As espécies mais isoladas foram do complexo C. parapsilosis (59%), C. tropicalis (19%), consideradas as espécies mais associadas à candidemia na América Latina, e C. guilliermondii (13%), associada a fenômenos de resistência cruzada e multirrestistência, não sendo isolada amostra de C. albicans. Todas as amostras isoladas foram capazes de produzir biofilme, com biofilmes metabolicamente ativos. Biofilmes do complexo C. parapsilosis e C. tropicalis apresentaram menor atividade metabólica em relação aos isolados de C. famata, C. glabrata e C. guilliermondii. Os isolados não apresentaram resistência a Fluconazol e Anfotericina B e os bioativos demonstraram atividade. Os resultados dos testes de sensibilidade em biofilmes demonstram um grande aumento dos valores de IC quando comparados aos valores obtidos para células planctônicas, variando de 256 a >2.048 vezes no caso do Fluconazol e de 16 a 256 vezes para Anfotericina B. Os bioativos vegetais estudados apresentaram boa atividade sobre biofilmes, especialmente a Guttiferona-A. Os resultados demonstram a importância da implementação de técnicas padronizadas de ensaio de sensibilidade antifúngica em biofilmes e a importância da pesquisa de contaminação ambiental, auxiliando no estabelecimento da cadeia epidemiológica de infecções em ambientes hospitalares.
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    ItemAcesso aberto (Open Access)
    Comparação do perfil associado à virulência e da sensibilidade antifúngica entre amostras de Candida ssp em casos de colonização de ambiente hospitalar e infecção hospitalar/
    (Universidade Federal de Alfenas, 2011-02-25) Ferreira, Alessandro Vieira; Dias, Amanda Latercia Tranches; Paula , Claudete Rodrigues; Chavasco, Jorge Kleber
    Este estudo visou comparar as leveduras do gênero Candida encontradas em fontes de infecção com as leveduras colonizantes de diversos locais de superfície e ambiente, tendo como critérios os fatores associados à virulência. Houve um predomínio de Candida albicans (32%) seguido de C. parapsilosis (20%), C. lusitaniae (20%), C. krusei (8%) e C. guilliermondii (4%) em fontes de infecção. Em relação às espécies colonizantes, observaram-se C. tropicalis (33,4%), C. lusitaniae (21,2%), C. parapsilosis (18,2%), C. albicans (15%), C. famata (6,1%) e C. guilliermondii (6,1%). Quanto aos fatores associados à virulência observou-se ß hemólise em 19,7% dos isolados, α hemólise em 21,3% e não foi observada atividade hemolítica em 70% dos isolados. Dentre as amostras, houve sensibilidade para Anfotericina B em 100% das mesmas e em 98,57% para fluconazol. Das leveduras de C. albicans provenientes de fontes de infecção 100% demonstraram potencial de formação de biofilme. As espécies não-albicans com maior produção de biofilme foram C. krusei (100%), C. parapsilosis (75%), C. tropicalis (75%). Nas amostras oriundas de colonização, 100% de C. albicans desenvolveram biofilme e dentre as não-albicans destacaram-se C. parapsilosis (80%), C. tropicalis (77,78%). Elevadas capacidade de formação de biofilme e atividade metabólica foram observadas em 35,3% das espécies de Candida spp. Em Candida spp provenientes de fontes de colonização 33,3% apresentaram capacidade intermediária de produção de biofilmes mas com atividade metabólica alta.