Doutorado em Ciências Farmacêuticas

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Análise da microbiota em fase aguda da esquistossomose hepática e intestinal e a possível interação de espécies de Schistosoma e bactérias
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-03-02) Araújo, Matheus Pereira De; Marques, Marcos José; Dias, Amanda Latércia Tranches; Rodrigues, Maria Rita; Caldas, Ivo Santana; Colombo, Fabio Antonio
A esquistossomose, causada por espécies do trematódeo Schistosoma, é uma doença negligenciada, muito comum em países em desenvolvimento, e mais de 200 milhões de pessoas necessitam de tratamento. Na evolução da esquistossomose há um comprometimento da estrutura morfológica e funcional do trato gastrointestinal. Nestas condições, as bactérias da própria microbiota intestinal podem chegar à corrente sanguínea, ou se associar ao verme adulto e ovo. Assim, no presente trabalho, foi realizada uma revisão literária a respeito da interação microbiota, geohelmintos e esquistossomose. Experimentalmente, a composição da microbiota de camundongos BALB/c em fase aguda da esquistossomose mansônica e japônica e os eventuais impactos da infecção no intestino e no fígado foram analisados. Houve divisão de 5 grupos de animais: CBr controle do Brasil e SmBr infectado com S. mansoni do Brasil; CJp controle do Japão; SmJp infectado com S. mansoni no Japão e SjJp infectado com S. japonicum no Japão. Desta forma, a análise da microbiota intestinal foi realizada a partir da obtenção do DNA das fezes de camundongos e posterior sequenciamento metagenômico. Embora a contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) nas fezes dos infectados (SmBr) foi maior que no controle, esta diferença não foi estatisticamente significativa (p = 0,3637), assim como nos grupos SmJp e SjJp (p = 0,5564). Os resultados de metagenômica para SmBr indicam um aumento no número de bactérias pertencentes ao filo Bacteroidetes (56,6% para 77%) e diminuição do filo Firmicutes (37,5% para 13,9%) na microbiota intestinal. Os resultados do PCR quantitativo para o filo Bacteroidetes confirmaram os resultados obtidos na metagenômica, encontrando maior quantidade no grupo SmBr, assim como diminuição de Firmicutes. Os fígados dos animais dos grupos controle e infectado foram obtidos também para avaliar a composição da microbiota, e somente os animais infectados apresentaram bactérias no fígado. A análise molecular mostra a presença de bactérias do filo Firmicutes, Bacteroidetes e Proteobacterias. Quatro espécies de bactérias foram isoladas do fígado dos animais SmBr e a identificação dessas foi realizada pela técnica de MALDI-TOF (Bordetella hinzii, Haemophilus haemolyticus, Lactococcus garvieae e Escherichia coli); SmJp (Staphylococcus nepalensis e Staphylococcus sciuri) e SjJp (Enterococcus galinarum, Staphylococcus sciuri e Paenibacillus). Ensaios para determinar o perfil de sensibilidade das bactérias à diferentes antibióticos (Clindamicina, Doxiciclina, Eritromicina, Gentamicina, Levofloxacino e Sulfametoxazol + Trimetoprima) mostraram que todas as espécies estudadas apresentaram sensibilidade para Gentamicina. Este antibiótico apresentou maior eficácia tanto pela análise de Concentração Inibitória Mínima como pela Concentração Microbicida Mínima. Para Eritromicina, as bactérias B. hinzii, L. garvieae, S. nepalensis e S. sciuri apresentaram sensibilidade. Já para o Levofloxacino, H. haemolyticus, E. coli, L. garvieae, S. nepalensis e S. sciuri foram sensíveis. Nos cortes histológicos, foi possível observar granulomas esquistossomóticos do tipo exsudativo no fígado; e no intestino foram identificados retenção de ovos dos parasitos na camada mucosa e aumento da celularidade, a qual foi constituída por acúmulo de células mononucleares e polimorfonucleares. Foi possível verificar também que algumas bactérias são capazes de aderir à superfície dos vermes adultos (E. coli) e dos ovos (L. garvieae) de S. mansoni. Os resultados obtidos indicam uma alteração na microbiota intestinal com possível disseminação das bactérias para outros órgãos, tais como o fígado, evidenciando uma possível translocação bacteriana
Schistosomiasis, caused by species of the trematode Schistosoma, is a neglected disease, very common in developing countries, and more than 200 million people need treatment. In the evolution of schistosomiasis there is a compromise in the morphological and functional structure of the gastrointestinal tract. Under these conditions, bacteria from the intestinal microbiota itself can reach the bloodstream, or associate with the adult worm and egg. Thus, in the present work, a literary review was carried out regarding the microbiota, geohelminth and schistosomiasis interaction. Experimentally, the composition of the BALB/c mice microbiota in the acute phase of mansonic and japanese schistosomiasis and the possible impacts of the infection on the intestine and liver were analyzed. There was a division of 5 groups of animals: CBr control from Brazil and SmBr infected with S. mansoni from Brazil; CJp control of Japan; SmJp infected with S. mansoni in Japan and SjJp infected with S. japonicum in Japan. Thus, the analysis of the intestinal microbiota was performed by obtaining the DNA from the feces of mice and subsequent metagenomic sequencing. Although the count of Colony Forming Units (CFU) in the feces of the infected (SmBr) was higher than in the control, this difference was not statistically significant (p = 0.3637), as well as in the SmJp and SjJp groups (p = 0.5564). The results of metagenomics for SmBr indicate an increase in the number of bacteria belonging to the phylum Bacteroidetes (56.6% to 77%) and a decrease in the phylum Firmicutes (37.5% to 13.9%) in the intestinal microbiota. The results of the quantitative PCR for the phylum Bacteroidetes confirmed the results obtained in the metagenomics, finding a greater quantity in the SmBr group, as well as a decrease in Firmicutes. The livers of the animals in the control and infected groups were also obtained to evaluate the composition of the microbiota, and only the infected animals had bacteria in the liver. Molecular analysis shows the presence of bacteria from the phylum Firmicutes, Bacteroidetes and Proteobacterias. Four species of bacteria were isolated from the liver of SmBr animals and their identification was performed using the MALDI TOF technique (Bordetella hinzii, Haemophilus haemolyticus, Lactococcus garvieae and Escherichia coli); SmJp (Staphylococcus nepalensis and Staphylococcus sciuri) and SjJp (Enterococcus galinarum, Staphylococcus sciuri and Paenibacillus). Tests to determine the sensitivity profile of bacteria to different antibiotics (Clindamycin, Doxycycline, Erythromycin, Gentamicin, Levofloxacin and Sulfamethoxazole + Trimethoprim) showed that all species studied showed sensitivity to Gentamycin. This antibiotic showed greater efficiency both by the analysis of Minimum Inhibitory Concentration and by the Minimum Microbicide Concentration. For Erythromycin, the bacteria B. hinzii, L. garvieae, S. nepalensis and S. sciuri showed sensitivity. As for Levofloxacino, H. haemolyticus, E. coli, L. garvieae, S. nepalensis and S. sciuri were sensitive. In histological sections, it was possible to observe exudative schistosomal granulomas in the liver; and in the intestine, egg retention of parasites in the mucous layer and increased cellularity were identified, which consisted of accumulation of mononuclear and polymorphonuclear cells. It was also possible to verify that some bacteria are able to adhere to the surface of adult worms (E. coli) and eggs (L. garvieae) of S. mansoni. The results obtained indicate a change in the intestinal microbiota with possible spread of bacteria to other organs, such as the liver, showing a possible bacterial translocatio
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da atividade e do mecanismo de ação de derivados de pentamidina em diferentes espécies de Leishmania
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-12-12) Sepini, Patrícia Ferreira Espuri; Marques, Marcos José; Laurenti, Márcia Dalastra; Almeida, Letícia De; Lucas, Rosymar Coutinho De; Rodrigues, Maria Rita
A leishmaniose abrange doenças causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gênero Leishmania, sendo um problema global de saúde pública. A quimioterapia é o principal tratamento, mas apresenta alta toxicidade, custo elevado, efeitos colaterais e resistência parasitária, destacando a necessidade de novas opções terapêuticas. A pentamidina, embora eficaz, é altamente tóxica, o que motiva a busca por derivados com menor toxicidade. Este estudo avaliou a atividade leishmanicida dos derivados de pentamidina (PQM 250 a PQM 262) em Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (L.) infantum chagasi e sua toxicidade em macrófagos de mamíferos. Além disso, foi investigado o mecanismo de ação dos compostos promissores, focando na bioenergética mitocondrial pelo potencial de membrana mitocondrial e produção de ATP, estresse oxidativo pela produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), NADPH e atividade da tripanotiona redutase (TryR), além de apoptose, estudos in sílico e in vivo. Os compostos PQM 250, PQM 254 e PQM 261 mostraram atividade significativa contra formas promastigotas e amastigotas nas duas espécies estudadas e com menor toxicidade, sendo selecionados para estudos de mecanismo de ação. Os resultados com Leishmania (L.) amazonensis mostraram que a pentamidina e o PQM 254 causaram despolarização mitocondrial (10,9 e 10,44%, respectivamente) enquanto o PQM 261 induziu hiperpolarização (13,16%). O PQM 261 também aumentou a produção de ATP e NADPH (32 e 18,35%, respectivamente), enquanto a pentamidina reduziu esses parâmetros (73 e 35,86%, respectivamente), além da redução na produção de H2O2 (37,9%) e promoveu apoptose. O PQM 250 aumentou a produção de H2O2 e NADPH (18,9 e 14,89%, respectivamente), inibindo a TryR em 21%, provocando assim desequilíbrio redox. PQM 254 reduziu a produção de H2O2 em 41,7%, mas inibiu a TryR em 13,38%, prejudicando a homeostase redox. Já com relação a Leishmania (L.) infantum chagasi, os resultados preliminares mostram que os compostos PQM 254 e PQM 261 promoveu aumento de 211,3% e 311,3% na concentração de H2O2, respectivamente, e que apenas o composto PQM 254 apresentou uma redução significativa de 21,6% nas taxas de NADPH em comparação com o grupo controle. Diante os ensaios in vivo, a qPCR demonstrou que com compostos PQM 250 e 254 reduziram significativamente a carga parasitária do fígado e baço dos animais em relação ao grupo controle. Os dados sugerem que derivados da pentamidina mostram-se promissores no desenvolvimento de terapias mais eficazes contra a leishmaniose ao interferirem em mecanismos críticos relacionados à sobrevivência do parasita. Este estudo oferece contribuições valiosas sobre as vias metabólicas nas quais os compostos afetam, proporcionando uma base importante para futuras abordagens terapêuticas.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação dos aspectos farmacológicos, toxicológicos e esquistossomicida da benzofenona 7-epiclusianona
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-08-15) Castro, Aline Pereira; Marques, Marcos José; Pinto, Pedro Luiz Silva; Lescano, Susana Angélica Zevallos; Sousa, Raquel Lopes Martins; Pacheco, Larissa Helena Lobo Torres
A esquistossomose é uma doença causada por helmintos do gênero Schistosoma, que afeta cerca de 230 milhões de pessoas no mundo. Recentemente, cepas de Schistosoma mansoni tem desenvolvido tolerância e resistência contra o praziquantel (PZQ) que é o único fármaco disponível no mercado, usado no tratamento dessa doença. Estes problemas relacionados à resistência justificam estudos que busquem alternativas para a prevenção, tratamento e cura da doença. Este trabalho teve como objetivo avaliar a estabilidade química, a farmacocinética, os efeitos tóxicos e esquistossomicidas da 7-epiclusianona (7-epi), uma substância isolada da Garcinia brasiliensis. Ensaios de estabilidade química usando HPLC-UV-VIS, farmacocinéticos utilizando UPLC-MS/MS, bioquímicos avaliando marcadores de função hepática (aspartato-aminotransferase, alaninaaminotransferase, albumina, proteínas totais e glicose) e renal (creatinina), toxicidade in vivo pelo teste cometa, micronúcleo de medula e colon e apoptose foram realizados com o objetivo de avaliar os efeitos dessas substâncias em modelos murinos. A 7-epi se demonstrou estável nos testes de degradação forçada, contudo na presença de peróxido de hidrogênio 0,3% (v/v) ocorreu degradação dando origem a forma oxidada deste composto. Por sua vez, os testes farmacocinéticos analisaram a 7-epi em plasma de camundongos infectados com Schistosoma mansoni, a qual apresentou um aumento da área sob a curva de concentração plasmática versus tempo (20846 vs 32438 ng.h/mL), uma diminuição da depuração total aparente (0,006 vs 0,004 L/h/kg), aumento da meia-vida (1,73 vs 6,11h) e a redução concentração plasmática máxima (5427,5 vs 3321,0 ng/mL) em comparação com o grupo não infectado, mas o tempo para atingir concentração plasmática máxima não apresentou diferença significativa. Nos testes toxicológicos usando ensaio cometa, teste de micronúcleo de medula e colon; além dos testes de apoptose, a 7-epi não provocou lesão no DNA e ainda foi capaz de proteger a célula contra a lesão provocada pela doxirrubicina e N,N’–dimetilhidrazina. Enquanto que na avaliação bioquímica apesar da 7-epi não provocar efeitos tóxicos para o hospedeiro, ela não foi capaz de corrigir os danos causados pelos ovos de S. mansoni. Nos testes esquistossomicida in vivo não foram observados efeitos significativos no verme adulto, quando os camundongos infectados foram tratados com 7-epi, porém houve uma redução da área do granuloma (46,0%) e da contagem de eosinófilos no tecido hepático (45,0%). A 7-epi não demonstrou toxicidade nos parâmetros avaliados e ainda foi capaz de proteger a células contra os danos causados pelos agentes lesivos. Os resultados obtidos mostraram uma significativa atividade esquistossomicida in vivo na dose de 300 mg/Kg. Além disso, houve redução no tamanho do granuloma. Embora, estes resultados sejam preliminares apontam para a importância de avaliar in vivo a atividade dessa substância usando diferentes regimes de tratamento e formulações de 7-epi lipossomada para melhorar sua eficácia.
Acesso aberto (Open Access)
Extratos bioativos e óleos essenciais de plantas endêmicas da República Dominicana no controle de nematoides gastrointestinais de pequenos ruminantes
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-11-19) Espino Ureña, Marcos Javier; Marques, Marcos José; Ribeiro, Wesley Lyeverton Correira; Bevilaqua, Claudia Maria Leal; Vilela, Vinícius Longo Ribeiro; Rodrigues, Maria Rita
A produção de pequenos ruminantes enfrenta perdas econômicas significativas devido às doenças causadas por nematoides gastrointestinais (NGI) que desenvolvem rapidamente resistência anti-helmíntica. A fitoterapia é uma alternativa promissora para controlar esses parasitos. Este estudo teve como objetivo avaliar extratos, frações e óleos essenciais de plantas endêmicas da Hispaniola tais como: Pimenta racemosa var. ozua (Po), Pimenta haitiensis (Ph), Croton coronatus, Croton poitaie, Simarouba berteroana (Sb) e Lippia dominguensis (Ld), no controle in vitro de Haemonchus contortus (kokstad) e in vivo de NGI de pequenos ruminantes. Foram realizadas análises químicas espectrofotométricas e cromatográficas para determinar o perfil químico dos derivados vegetais, sendo também avaliada a toxicidade aguda in vivo dos mais promissores. No teste de inibição da eclosão de ovos, foi observado que os óleos essenciais foram mais ativos do que os extratos e as frações, apresentando concentrações inibitórias de 50% (IC50) de 0,294 mg/mL (óleo essencial de Ph: OEPh), 0,313 mg/mL (óleo essencial de Ld 2º coleta: OELd2), e 0,8 – 1,38 mg/mL (óleos essenciais de Po). A fração hexânica da 2º coleta do extrato da Po (IC50 = 0,65 mg/mL) e a fração hidroalcóolica 1º coleta de S. berteroana (IC50 = 0,925 mg/mL) também apresentaram potentes efeitos de inibição da eclosão de ovos. A maioria dos extratos e frações inibiram o processo de desembainhamento larval de H. contortus a 300 µg/mL, com a exceção das frações hexânicas. No teste de motilidade do nematoide adulto, após 3h de exposição, os óleos essenciais de L. dominguensis 1º coleta (OELd1) e da Po 1º coleta (OEPo1), a 1 mg/mL, inibiram a motilidade > 95%. Estes óleos causaram alterações na cutícula de nematoides adultos, observadas por meio de microscopia eletrônica de varredura. A cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas indicou que os compostos majoritários do OELd1 foram: linalol (33,85%) e 1,8-cineol (30,88%), do OEPo1: 1,8-cineol (93,7%), e do OEPh: estragol (66,32%) e mentatrieno <1,3,8-ρ-> (17,66%). As frações isobutanol e acetato de etila da S. berteroana foram as que apresentaram maiores teores de fenóis, flavonoides e taninos totais, por espectrofotometria. A cromatografia liquida acoplada a espectrometria de massas mostrou que os extratos brutos e frações de S. berteroana possuíam quassinoides, quinonas terpenoides, lipídios de fitosteróis, alcaloides e a naftoquinona javanicina D. No teste de toxicidade oral aguda em camundongos, foi observado que o OELd1 e o óleo essencial de Po 2º coleta (OEPo2) e o do extrato bruto de Po2 apresentaram baixa toxicidade (DL50 > 2.000 mg/kg), e a DL50 do OELd2, OEPh e do extrato bruto de Sb 2º coleta (Sb2) foi entre 1.100 – 2.000 mg/kg. Nos experimentos com caprinos, foi observado que 350 mg/kg de Sb2 diminuindo a carga parasitária em 71% no dia 14, apresentando uma eficácia concentraçãodependente. Portanto, o extrato bruto Sb2, contendo quassinoides e um teor significativo de fenólicos, foi o derivado vegetal mais promissor de S. berteroana. Da mesma forma, os óleos essenciais de Ld (contendo linalol e piperitenona) e de Ph (contendo estragol), podem ser considerados para o desenvolvimento de agentes anti-helmínticos para pequenos ruminantes.
Acesso aberto (Open Access)
Impactos da associação de doxiciclina e gentamicina com praziquantel no tratamento da esquistossomose murina aguda e análise comparativa de microbiotas
(Universidade Federal de Alfenas, 2024-08-30) Lopes, Marisa De Oliveira; Marques, Marcos José; Rosa, Florence Mara; Crispim, Marcell; Dias, Amanda Latércia Tranches; Rodrigues, Maria Rita
Introdução e objetivos: A esquistossomose ocorre nas formas aguda e crônica, diferindo na patogênese e na resposta imune do hospedeiro, com impactos da microbiota e de medicamentos no desfecho da doença. Este estudo avaliou os efeitos do praziquantel (PZQ) em associação com doxiciclina (DOX) e gentamicina (GEN) no tratamento de camundongos BALB/c infectados com Schistosoma mansoni na fase aguda da esquistossomose, além de uma análise metataxonômica de fezes e fígado de camundondos não-infectados e infectados. Métodos: Foram avaliados os granulomas hepáticos e intestinais por análises histopatológicas, quantificação da carga parasitária no tecido hepático (PCR em tempo real e contagem de ovos) e parâmetros bioquímicos: ALT, AST, Fosfatase alcalina e albumina por métodos enzimáticos colorimétricos. A análise metataxonômica, utilizando sequenciamento do gene 16S rRNA de fezes e fígado, foi feita em dois grupos experimentais, nãoinfectados e infectados. Principais achados: No grupo infectado e tratado com a associação PZQ+DOX foram observados granulomas com um diâmetro maior e um extenso infiltrado de células inflamatórias ao redor de ovos de S. mansoni, característicos do tipo necrótico-exsudativo, além de uma desorganização na estrutura de colagenização. Nos camundongos do grupo infectado e tratados com PZQ+GEN observou-se que os granulomas eram de dimensões reduzidas, apresentando maior quantidade de células gigantes ao redor dos ovos e fibroblastos organizados em camadas concêntricas, embora estas alterações não diferiram estatisticamente. Houve maior expressão percentual de granulomas na fase exsudativa-produtiva com os tratamentos, sendo o grupo tratado com a associação PZQ+GEN o que apresentou a maior porcentagem destes granulomas em relação ao grupo tratado somente com o PZQ. Todos os tratamentos causaram uma diminuição significativa na redução do número de ovos no fígado como também redução de material genético de S. mansoni por mg de tecido hepático analisado por PCR-Tempo real. A associação PZQ+DOX potencializou o dano inflamatório associado aos granulomas hepáticos, como também observado em maiores níveis de ALT. Nos animais tratados com PZQ+GEN há um aumento significativo nos níveis de AST. Em relação à composição da microbiota intestinal observa-se que a infecção provocou um aumento na abundância relativa de Bacteroidia (filo Bacteroidetes) enquanto diminuiu a abundância de Clostridia (filo Firmicutes) com diferença estatística significante. Conclusão: A associação de PZQ com DOX e GEN foi capaz de alterar a modulação do processo granulomatoso, com DOX agravando a inflamação associada ao processo granulomatoso e GEN acelerando a resolução da esquistossomose em um modelo experimental murino de infecção aguda por S. mansoni. Nas análises de sequenciamento do gene 16S rRNA observa-se que, na microbiota fecal, a infecção provocou, já na fase aguda, um aumento estatisticamente diferente de Bacteroidetes e diminuição de Firmicutes. No fígado dos camundongos BALB/c infectados e nãoinfectados houve alterações sutis entre a composição microbiana, porém os desvios observados na comunidade microbiana entre as amostras do fígado, neste estudo, não foram impactantes a nível de gerar variações estatisticamente significativas, muito embora por corresponder à fase aguda da esquistossomose.
Introduction and objectives: Schistosomiasis occurs in acute and chronic forms, differing in pathogenesis and host immune response, with impacts of microbiota and drugs on disease outcome. This study evaluated the effects of praziquantel (PZQ) in combination with doxycycline (DOX) and gentamicin (GEN) in the treatment of BALB/c mice infected with Schistosoma mansoni in the acute phase of schistosomiasis, in addition to a metataxonomic analysis of feces and liver of uninfected and infected mice. Methods: Hepatic and intestinal granulomas were evaluated by histopathological analysis, quantification of parasite load in liver tissue (real-time PCR and egg count) and biochemical parameters: ALT, AST, alkaline phosphatase and albumin by enzymatic colorimetric methods. Metataxonomic analysis using 16S rRNA gene sequencing of feces and liver was performed in two experimental groups, uninfected and infected. Main findings: In the infected group treated with the PZQ+DOX combination, granulomas with a larger diameter and an extensive infiltration of inflammatory cells around S. mansoni eggs, characteristic of the necrotic-exudative type, were observed, in addition to a disorganization in the collagenization structure. In the mice in the infected group treated with PZQ+GEN, it was observed that the granulomas were of reduced dimensions, presenting a greater quantity of giant cells around the eggs and fibroblasts organized in concentric layers, although these changes did not differ statistically. There was a higher percentage of granulomas in the exudative-productive phase with the treatments, with the group treated with the PZQ+GEN combination presenting the highest percentage of these granulomas in relation to the group treated only with PZQ. All treatments caused a significant decrease in the number of eggs in the liver as well as a reduction in the genetic material of S. mansoni per mg of liver tissue analyzed by real-time PCR. The PZQ+DOX combination potentiated the inflammatory damage associated with hepatic granulomas, as also observed in higher ALT levels. In animals treated with PZQ+GEN there was a significant increase in AST levels. Regarding the composition of the intestinal microbiota, it was observed that the infection caused an increase in the relative abundance of Bacteroidia (phylum Bacteroidetes) while decreasing the abundance of Clostridia (phylum Firmicutes) with a statistically significant difference. Conclusion: The combination of PZQ with DOX and GEN was able to alter the modulation of the granulomatous process, with DOX aggravating the inflammation associated with the granulomatous process and GEN accelerating the resolution of schistosomiasis in an experimental murine model of acute infection by S. mansoni. In the sequencing analyses of the 16S rRNA gene, it was observed that, in the fecal microbiota, the infection caused, already in the acute phase, a statistically different increase in Bacteroidetes and a decrease in Firmicutes. In the liver of infected and uninfected BALB/c mice, there were subtle changes in the microbial composition, but the deviations observed in the microbial community between the liver samples in this study were not impactful enough to generate statistically significant variations, although they correspond to the acute phase of schistosomiasis.

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Navegando Doutorado em Ciências Farmacêuticas por Orientador(a) "Marques, Marcos José"