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Avaliação do potencial bioativo do produto de fermentação de actinomicetos isolados de terra preta antropogênica da Amazônia
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-02-23) Amorim, Letícia Ferraz De Sena; Ariosa, Marília Caixeta Franco; Dias, Disney Ribeiro; Ikegaki, Masaharu
A terra preta antropogênica da Amazônia (TPA), ou terra preta de índio, possui grande diversidade microbiana. Diante do aumento da resistência de micro-organismos patogênicos aos antibióticos disponíveis e da importância de antioxidantes na prevenção do dano oxidativo celular, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial bioativo de extratos provenientes do produto da fermentação de actinomicetos isolados de TPA. Cinco actinomicetos (FL1, FL2, FL3, FL4 e FL5) não identificados, isolados de TPA da Amazônia Central, foram submetidos à fermentação e seus extratos foram obtidos com acetato de etila. Ensaios de concentração inibitória mínima (CIM) e microbicida mínima (CMM) foram realizados com os cinco extratos frente a três cepas microbianas: Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Os extratos que obtiveram os melhores resultados de atividade antimicrobiana foram analisados por cromatografia em camada delgada (CCD), e fracionados em coluna Sephadex LH-20. As frações foram avaliadas por CCD com diferentes reveladores químicos e submetidas a ensaios de CIM e CMM contra a cepa que apresentou maior sensibilidade nos testes com os extratos brutos. A fração mais promissora foi submetida a ensaios de detecção e quantificação de fenólicos e atividade antioxidante, e também foi analisada por cromatografia líquida de alta eficiência e espectroscopia no ultravioleta - visível. Frações que apresentaram atividade antimicrobiana foram avaliadas quanto ao potencial de ação sinérgica em associação com a amoxicilina e quanto à sua citotoxicidade frente a células Vero. Experimentos para identificação dos actinomicetos considerados promissores foram iniciados com o sequenciamento do gene 16S do rRNA. As linhagens FL3 e FL4 se sobressaíram quanto ao potencial antimicrobiano frente a S. aureus e foram selecionadas, juntamente com seus respectivos extratos, para dar continuidade ao trabalho. O extrato FL3 apresentou CIM de 100- 200 μg/mL, e o extrato FL4 apresentou CIM de 25-50 μg/mL e CMM de 100-200 μg/mL. O fracionamento do extrato FL3 resultou em quatro frações, sendo que duas delas, B3 e C3, apresentaram os melhores valores de CIM, entre 100-200 μg/mL. A partir do extrato FL4 foram obtidas seis frações, sendo relevante mencionar os melhores valores de CIM observados para B4 e D4: entre 50 e 100 μg/mL. Dentre estas, apenas a fração B4 apresentou atividade microbicida, com CMM de 100-200 μg/mL. Nos ensaios químicos preliminares das frações foi possível sugerir a presença de grupos cromóforos, aminas primárias, flavonoides e terpenos e substâncias com ação antioxidante. A fração D4 apresentou 140,71 ± 4,0105 mg de GAE/g de fração, e obteve promissores resultados de atividade antioxidante no método ORAC: 5581,85 ± 515,1450 μmol de Trolox/g da fração. A associação entre as frações A3, B3 e D4 e o antimicrobiano amoxicilina potencializou a ação do fármaco em até quatro vezes. Na avaliação da citotoxicidade, as frações B3, B4, C4 e D4 foram consideradas mais efetivas do que tóxicas às células Vero (IS > 1). O sequenciamento do gene 16S, juntamente com a posição filogenética dos isolados FL3 e FL4 entre as espécies mais próximas, mostrou que ambos pertencem à família Streptomycetaceae, sendo prováveis espécies do gênero Streptomyces.
Acesso aberto (Open Access)
Caracterização de isolados de Candida spp de cavidade bucal quanto aos aspectos fenótípicos e moleculares e obtenção de mutantes heteroresistentes à antotericina B e fluconazol
(Universidade Federal de Alfenas, 2007-07-13) Claudino, André Luís Ribeiro; Ariosa, Marília Caixeta Franco; Giannini, Maria José Soares Mendes; Melhem, Márcia De Souza Carvalho
Nos últimos anos o aumento na incidência de candidose superficial e invasiva causada por espécies emergentes resistentes tem sido atribuído a disseminação do uso de antibióticos e agentes imunossupressores. O aumento de Candida não-albicans deve-se ao incremento de pacientes imunodeprimidos, neutropênicos, recém nascidos de baixo peso, procedimentos invasivos e iatrogenia. Todos esses fatores permitem que agentes pouco virulentos, causem doenças. Vários estudos bioquímicos e moleculares foram realizados no sentido de elucidar as causas da resistência a antifúngicos em leveduras. Os objetivos do presente estudo foram: estudar leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal de pacientes com e sem HIV; comparação de métodos de identificação dos isolados; determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos anfotericina B e fluconazol pelas metodologias de microdiluição CLSI, AFSTEUCAST e difusão em agar Etest e obter amostras heterorresistentes à anfotericina B e ao fluconazol por indução e seleção. Foram identificados 22 isolados de C. albicans, 3 de C. tropicalis, 3 de C. parapsilosis e 2 de C. glabrata segundo o método clássico. A identificação por métodos morfológicos e bioquímicos foi 100% concordante com o método molecular (PCR), tanto pela amplificação dos primers espécies-específicos (C. albicans e C. dubliniensis) quanto pela comparação do tamanho do fragmento amplificado pelos primers da região ITS2. A correlação entre a metodologia Etest e os dois métodos de microdiluição foi alta. Todas as amostras selvagens foram sensíveis a anfotericina B (CIM£2,0μg/mL) e apenas um isolado (3,33%) de C. tropicalis foi resistente ao fluconazol (CIM³64,0μg/mL por CLSI e CIM³64,0μg/mL por AFST-EUCAST). Foram selecionadas amostras heteroresistentes através da pressão seletiva utilizando meio adicionado de fluconazol (8μg/mL) e em seguida com anfotericina B (1,0μg/mL). A pressão seletiva também foi feita iniciando-se com anfotericina B e em seguida fluconazol. Paralelamente, as amostras selvagens foram submetidas à indução de resistência através do cultivo primeiro em concentrações crescentes de fluconazol (16,0; 32,0; 64,0; 128 e 256mg/mL) e em seguida com anfotericina B (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0mg/mL). Os testes também foram feitos invertendo-se os antifúngicos, iniciando com anfotericina B e depois fluconazol. Foram obtidas três amostras heterorresistentes a fluconazol, das quais duas foram por indução (C. glabrata e C. tropicalis) e uma por seleção (C. tropicalis.). Ambas amostras de C. tropicalis foram originadas de um mesmo isolado selvagem. Nenhuma amostra mudou seu perfil de sensibilidade para anfotericina B, apesar de alguns isolados apresentarem capacidade de crescimento em várias concentrações deste antifúngico (1,0 a 3,0μg/mL). Após cultivos sucessivos em meio livre de droga, somente a cepa obtida por seleção manteve seu fenótipo de resistência. As cepas selvagens e suas mutantes apresentaram o mesmo perfil quando comparadas pela amplificação da região ITS2. Conclui-se que, embora a maior parte das espécies estudadas seja C. albicans (73,33%) todas as amostras heteroresistentes ao fluconazol obtidas foram Candida nãoalbicans (10%). As duas cepas mutantes obtidas pelo mesmo isolado inicial possuem, possivelmente, mecanismos múltiplos e distintos de resistência que, associado ao isolado, conferem resistência e/ou adaptabilidade à levedura frente ao antifúngico.
Acesso aberto (Open Access)
Detecção e quantificação da expressão do gene ERG11 de Candida albicans sob diferentes concentrações de fluconazol
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-01-26) Oliveira, Josimary Morais Vasconcelos; Ariosa, Marília Caixeta Franco; Lyon, Juliana Pereira; Dias, Amanda Latércia Tranches
Espécies de Candida habitam o corpo humano, não causam doenças em organismos considerados saudáveis, entretanto podem levar a infecções graves naqueles com alterações nos mecanismos de defesa e/ou quando ocorre comprometimento de barreiras anatômicas. O agente etiológico mais comum das infecções causadas por Candida spp. é C. albicans, inclusive no Brasil. Há muitos anos, antifúngicos da classe dos azóis vêm sendo prescritos para tratamentos de tais infecções, porém a incidência de casos de resistências tem sido documentada. A superexpressão do gene ERG11 e bombas de efluxo e mutações no gene ERG11 são descritos como mecanismos moleculares de resistência a azóis em Candida spp. Desta forma, analisar a expressão gênica do ERG11 de isolados clínicos e de fontes de colonização ambiental foi a proposta deste estudo, envolvendo tratamentos sob concentrações inibitórias e subinibitórais de fluconazol (FLU), nunca antes investigada. Assim, foram utilizados três isolados provenientes de fontes de colonização de ambiente hospitalar e cinco isolados clínicos, além da cepa padrão ATCC 10231 cujas concentrações inibitórias mínimas para fluconazol foram obtidas de acordo com o protocolo EUCAST Definitive Document EDef 7.1 (2008). Os tratamentos consistiram de concentrações inibitórias mínimas (CIM) e subinibitórias equivalentes a 1/4 e 1/2 da CIM do antifúngico e na ausência do mesmo. As quantificações das expressões por RT-qPCR foram realizadas para os genes ERG11, e o normalizador Actina. As análises de expressão relativa foram calculadas utilizando o método 2-ΔΔCt. Observou-se no comportamento de todos os isolados analisados, independente da origem de isolamento, inclusive a cepa padrão ATCC 10231, aumento significativo de expressão do gene ERG11 em relação aos tratamentos com CIM, 1/2 e 1/4 da CIM de FLU quando comparados aos mesmos isolados na ausência de FLU. Esse aumento variou entre 1,086 a 126,105. No grupo de isolados clínicos, aquele que mais expressou o gene alvo foi o 220 (126,10) e no grupo de colonização ambiental foi o isolado 521 (40,79), ambos no tratamento da CIM de fluconazol. Em geral, a maior dose de fluconazol (CIM) foi a que mais influenciou os isolados a expressarem ERG11, seguido dos tratamentos com 1/2 e 1/4 da CIM. Estes resultados, de aumento da expressão de isolados clínicos de C. albicans é relevante, especialmente nos casos de pacientes em tratamento profilático, quando o antifúngico ao invés de proteger o paciente da infecção poderia estar estimulando o patógeno. No caso dos isolados de colonização ambientais terem apresentado o mesmo comportamento, gera um alerta para a importância na higienização no ambiente hospitalar e antissepsia dos profissionais da área da saúde.
Acesso aberto (Open Access)
Leishmaniose tegumentar americana: análise epidemiológica de pacientes de diferentes regiões de Minas Gerais e caracterização molecular do gênero Leishmania
(Universidade Federal de Alfenas, 2007-10-16) Peloso, Eduardo De Figueiredo; Ariosa, Marília Caixeta Franco; Silva, Eduardo Sérgio Da; Silva, Paulo Márcio De Faria E
A leishmaniose tegumentar americana (LTA), uma das formas clínicas das leishmanioses, está em expansão no Brasil e representa importante causa de morbidade para populações residentes em áreas endêmicas. Avaliações do perfil epidemiológico, dos serviços de diagnóstico e tratamento são necessárias para o estabelecimento de estratégias de controle da doença, assim como o emprego de novas ferramentas laboratoriais, como a PCR. Neste trabalho foram avaliados os aspectos epidemiológicos, de diagnóstico e tratamento de pacientes com LTA de diferentes regiões de Minas Gerais, além do uso de diferentes técnicas de extração de DNA e de iniciadores na PCR para a identificação e diferenciação do agente etiológico. Adicionalmente, foi comparada a positividade dos iniciadores dirigidos para a região conservada (150/152) e variável (13Y/13Z) do minicírculo do kDNA de Leishmania em amostras biológicas de pacientes sugestivos para LTA. Foi realizado levantamento epidemiológico, de diagnóstico e tratamento de 824 pacientes portadores de LTA, sendo 261 da região sul e sudoeste do estado de Minas Gerais (SSMG) e 563 do Vale do Rio Doce (VRD). Os dados foram obtidos através das fichas de notificação das Gerências Regionais de Saúde (GRS) do SSMG e do ambulatório de Leishmanioses “Dr. Paulo Araújo Magalhães” de Caratinga (VRD) entre 2002 e 2006. Trinta e nove pacientes com lesões sugestivas para LTA, provenientes destas regiões foram submetidos a exames laboratoriais, além da PCR. As amostras de DNA foram extraídas por aquecimento, pela técnica do fenol/clorofórmio, proteinase K e kit Wizard, e posteriormente usadas na PCR e PCR-RFLP. No período analisado, foi observada diminuição de 59,7% dos casos de LTA no SSMG e de até 25,7% no VRD. A forma clínica cutânea foi a predominante, com 91,9 e 93,6% no SSMG e VRD respectivamente. No SSMG, a maioria dos pacientes (51,7%) tem residência urbana, enquanto que no VRD a rural foi predominante (95,7%). No SSMG houve positividade em 55,6, 10,7 e 19,5% dos casos de LTA no Teste de Montenegro (TM), nos exames parasitológico e histopatológico, respectivamente. No VRD a positividade dos casos de LTA foi de 84,0 no TM e 73,0% no exame parasitológico. A alta por cura com a medicação empregada variou de 71,8 a 92,0% no SSMG e chegou a 78,0% no VRD. Dos 39 pacientes sugestivos, 32 foram confirmados para LTA. As extrações permitiram observar que mesmo a partir de DNA total degradado foi possível detectar kDNA de Leishmania. Nas amostras sugestivas, a positividade com 13Y/13Z e 150/152 foi de 56,4 e 76,9% respectivamente. Nos pacientes confirmados para LTA, a positividade com 13Y/13Z foi de 68,7% e com 150/152 foi de 93,7%. O emprego dos iniciadores 150/152 foi mais viável, o que não descarta o uso de 13Y/13Z, dada a expressiva positividade alcançada em amostras que requerem extração simplificada de DNA e com baixo custo. A PCR-RFLP possibilitou a identificação de L. (V.) braziliensis nas amostras biológicas dos pacientes com LTA. Os dados do presente trabalho também reforçam a necessidade de ações que estabeleçam um centro de referência no diagnóstico e tratamento da LTA no SSMG.
The american tegumentary leishmaniasis, (ATL), one of clinic forms of leishmaniasis, is in expansion in Brazil and represent important cause of morbidity for populations who live in endemic areas. Profile epidemiological studies, health services and treatment are needs to establish strategies of disease control, as well as to employ new tools laboratorials, like PCR ones. This research evaluated the epidemiological aspects, diagnoses and treatment from patients with ATL from different regions Minas Gerais, beyond to use varied extraction techniques DNA and different primers in PCR to make possible the identification and differentiation of the etiological agents. Additionally, it compared the positivity of the primers addressed to the conserved (150/152) and variable (13Y/13Z) region of the Leishmania kDNA minicircle in biological samples of patients suggestive to ATL. It was to carried out epidemiological studies, diagnoses and treatment of 824 patients with ATL, being 261 from Southern and Southwestern regions of Minas Gerais state (SSMG) and 563 from river Doce valley (VRD). The data were obtained from notification files Regional Health Authorities – RHA of SSMG and from Leishmaniasis ambulatory “Dr. Paulo Araújo Magalhães” at Caratinga city (VRD) between 2002 and 2006. Thirty nine patients from these regions and with suggestive ATL lesions were submitted to laboratorial exams, beyond of the PCR. The DNA samples extracted by heating, phenol/ chloroform technique, proteinase K and by Wizard kit, and later used in the PCR and PCR-RFLP. In the period analyzed, it was observed decrease of 59.7% of ATL cases in SSMG and of up to 25.7% in VRD. The cutaneous clinic form was predominant with 91.9 and 93.6% in SSMG and VRD respectively. The greatest part of the patients from SSMG has urban residence (51.7%) while in VRD the rural was predominant (95.7%). In the SSMG there was positivity in 55.6, 10.7 and 19.5% of ATL cases in the Montenegro test (MT), parasitological and histopatological exams, respectively. In the VRD the positivity was 84.0 in the MT and 73.0% in the parasitological exam. Discharge from the treatment due to cure varied of 71.8 to 92.0% in the SSMG and reached 78.0% in VRD. From the 39 suggestive patients, 32 were confirmed to ATL. The DNA extractions allowed observing that even starting from total degraded DNA was possible to detect kDNA of Leishmania. In the suggestive samples, the positivity of DNA with 13Y/13Z and 150/152 was about 56.4 and 76.9% respectively. In the confirmed patients to ATL, the positivity to 13Y/13Z was about 68.7% and to 150/152 was of 93.7%. The employment of the primers 150/152 was viable, what doesn't discard the use of 13Y/13Z, given the expressive positivity reached in samples that request simplified extraction of DNA and with low cost. PCR-RFLP made possible the identification of L. (V.) braziliensis in the patients' biological samples with LTA. The data of the present work they also reinforce the need of actions that establish a reference center in the diagnosis and treatment of LTA in SSMG.