Mestrado em Ciências Biológicas

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Análise de expressão dos genes SAP9 e SAP10, de aspectos bioquímico e ultraestrutural em linhagem padrão de Candida albicans, em estado planctônico e biofilme, antes e após a associação de Fluconazol e Guttiferona A
(Universidade Federal de Alfenas, 2017-04-25) Lima, Camila Miranda Pernambuco De; Dias, Amanda Latercia Tranches; Loyola, Ana Beatriz Alkimim Teixeira; Coelho, Luiz Felipe Leomil
Introdução: Dentre as espécies de fungos causadoras de infecções na corrente sanguínea, Candida albicans é a prevalente. A compreensão dos fatores associados à virulência deste fungo, dentre eles, a expressão das isoenzimas Aspartato Proteases Secretadas (Sapp) e a formação de biofilmes, são de grande relevância na tentativa de se encontrar possíveis alvos terapêuticos. Objetivos: Avaliar os tipos de interação entre Fluconazol e Guttiferona A, em estado planctônico e biofilmes, por meio de análise morfotopográfica e da expressão gênica de SAP9 e SAP10, afim de verificar possíveis mecanismos de ação do composto Guttiferona A em C. albicans. Metodologia: Avaliamos a expressão gênica de SAP9 e SAP10, quantificamos o ergosterol produzido nas células sob tratamento e avaliamos por meio de microscopia de força atômica (AFM) características ultraestruturais em células planctônicas e biofilmes de Candida albicans, antes e após tratamento isolado e associado entre fluconazol (FLC) e Guttiferona A (GUT). Resultado: A linhagem SC5314, em estado planctônico, foi sensível ao FLC (0,125 μg/mL) e a GUT (7,5 μg/mL). As associações apesentaram efeito sinérgico com inibição de 75% do crescimento, de C. albicans (FICI=0,156). As células sob associação apresentaram alterações morfológicas, como aumento de tamanho (p<0,001), redução na produção do ergosterol (p<0,001), e redução na expressão de SAP9 e SAP10 em células planctônicas, quando comparadas ao controle. Nos biofilmes, o fungo apresentou resistência de mais de 2000 vezes quando tratado com as substâncias isoladamente e não houve atividade nas associações. GUT 1024 μg/mL promoveu um aumento na biomassa dos biofilmes (p<0,001) e, sob tratamentos com 16 μg/mL deste composto, as células apresentaram um aumento de tamanho em relação ao controle (p<0,001). Conclusão: A associação de GUT ao FLC apresenta potencial farmacológico contra C. albicans, promovendo uma atividade sinérgica com alterações significativas na estrutura deste fungo.
Acesso aberto (Open Access)
Análise diferencial da capacidade de formação de biofilmes e sensibilidade antifúngica de Candida albicans e espécies não-albicans de Candida isoladas de pacientes criticamente enfermos sujeitos a eventos adversos relacionados à assistência
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-09-23) Reis, André Francisco Dos; Dias, Amanda Latercia Tranches; Lucas, Rosymar Coutinho De; Oliver, Josidel Conceição
Objetivo. Este estudo objetiva a análise diferencial da capacidade de formação de biofilmes e da sensibilidade antifúngica de células planctônicas e biofilmes de Candida albicans e Candida spp. não- albicans isoladas de pacientes criticamente enfermos, sujeitos a eventos adversos relacionados à assistência. Metodologia. Foram avaliadas amostras de Candida spp. isoladas de secreção traqueal, urina, corrente sanguínea e outros sítios de pacientes, maiores de 18 anos, dos setores de Terapia Intensiva e Emergências da Irmandade do Hospital da Santa Casa de Poços de Caldas, sujeitos a incidentes que possam estar relacionados ao estabelecimento de infecção fúngica. Os isolados foram identificados por espectrometria de massa MALDI-TOF e avaliados quanto à sensibilidade das células planctônicas e dos biofilmes aos antifúngicos: anfotericina B, fluconazol e itraconazol. Os prontuários destes pacientes foram examinados a partir da data da 1ª internação até o momento de desfecho clínico, com alta ou óbito do paciente. A identidade dos pacientes e as informações contidas nos prontuários foram preservadas conforme Resolução CNS nº 466/2012. Os critérios de rastreamento adotados para a análise dos prontuários fizeram referência à assistência à saúde, à terapia intensiva e à prescrição de medicamentos. Resultados: Foram analisados os prontuários e as amostras de 43 pacientes. O tempo de internação variou de 1 a 127 dias e todos os pacientes foram submetidos, durante o período de sua internação, a um ou mais eventos adversos relacionados à assistência, tais como utilização de ventilação mecânica, cateter venoso central, cateter venoso periférico, sonda vesical de demora, utilização de substâncias vasoativas, dentre outros. Os 43 pacientes apresentaram positividade para cultura fúngica, sendo este um dos principais critérios para a seleção do paciente integrante desta pesquisa. Ressalta-se que do total de 43 amostras, 23 foram fenotipicamente identificadas como pertencentes à espécie C. albicans, e 20 como Candida ssp. não-albicans. Deste total, 33 amostras puderam ser identificadas por MALDI-TOF (51,5% C. albicans e 48,5% Candida spp. não albicans) e apresentaram a capacidade de formação de biofilmes, sendo que 30% dos isolados apresentaram biofilmes com elevado potencial metabólico. Quanto à sensibilidade antifúngica, observou-se uma relação direta com a sensibilidade à Anfotericina B e situações de baixa sensibilidade aos fármacos Itraconazol e Fluconazol, inclusive com situações de resistência. Conclusão: A relevância desta pesquisa assenta-se solidamente na necessidade cada vez maior de centros de saúde, tais como os hospitais, que lidam com pacientes criticamente enfermos, conhecerem obrigatoriamente sua comunidade fúngica e seus perfis de sensibilidade aos antifúngicos; bem como o percentual de formação de biofilmes que podem influenciar negativamente na capacidade de resolução dos processos infecciosos,na ação dos antifúngicos então utilizados, e sua correlação com o eventual e inevitável evento adverso relacionado à assistência.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da expressão de genes da resposta antioxidante de candida albicans na ausência e presença de concentrações subinibitórias de antifúngicos
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-08-09) Ferreira, Carla Benedini Ribeiro Jorge; Dias, Amanda Latercia Tranches; Melhem, Márcia De Souza Carvalho; Colombo, Fábio Antônio
Infecções fúngicas invasivas são consideradas um grave problema, principalmente no que se refere a pacientes imunocomprometidos e ao tratamento antifúngico. Dentre essas infecções, destacam-se as causadas pelo gênero Candida spp., principalmente C. albicans, por seus inúmeros fatores associados à virulência. Estas espécies apresentam inúmeros fatores associados à virulência e habilidade em evadir o sistema imune do hospedeiro, fazendo com que haja recorrência de infecções em âmbito hospitalar e na comunidade. No hospedeiro, as células fagocíticas respondem a diversos estímulos microbianos com a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), responsáveis, em parte, pela atividade microbicida dessas células, que atuam a nível proteico, lipídico e genético. Na resposta central frente ao ambiente oxidante encontra-se o gene CAP1, do inglês “adenylate cyclase-associated protein”, responsável pela ativação de diversos outros genes associados ao estresse oxidativo, e, cuja requisição à tolerância ao ambiente oxidante por C. albicans é conhecida. Ao decorrer da cascata antioxidante, outros genes são ativados, como os da família das SODs (SOD1-6) e catalase (CAT1), cujas funções são dismutar ERO tais como o superóxido e decompor o peróxido de hidrogênio, respectivamente. Os antifúngicos utilizados na clínica, tanto com finalidade profilática ou de tratamento, incluem anfotericina B, fluconazol e caspofungina, sendo de extrema importância os testes de sensibilidade para compor os guias terapêuticos de tratamento de candidíases. Tem sido atribuído a estes antifúngicos, como mecanismo de ação adicional, o aumento da produção de ERO, o que pode contribuir com o efeito positivo do tratamento, mas, em contrapartida, pode colaborar com o aumento da resistência do fungo a essas espécies. O trabalho objetivou avaliar o processo de fagocitose e a capacidade fungicida dos macrófagos frente às amostras tratadas com as concentrações subinibitórias dos antifúngicos anfotericina B, fluconazol e caspofungina, bem como a expressão diferencial dos genes CAP1, SOD1-6 e CAT1 em C. albicans SC4314, 121 e 221-V por RT-PCR. O tratamento com a caspofungina promoveu a maior expressão de, praticamente, todos os genes estudados, em todos isolados, porém todos os antifúngicos modularam, positiva ou negativamente, a expressão relativa de todos os genes. O pré-tratamento com a caspofungina parece ter protegido o fungo frente ao ataque de macrófagos. O tratamento com doses subinibitórias promove diversos tipos de estresse, dentre eles o oxidativo, o qual ocasiona alterações no perfil de transcrição de genes da resposta antioxidante e isso pode favorecer o fungo na luta contra o sistema imune do hospedeiro, podendo influenciar diretamente na terapia ou profilaxia antifúngica de doenças fúngicas invasivas de interesse médico.
Acesso aberto (Open Access)
Avaliação de Lavandula angustifolia Mill. e Lavandula dentata L. sobre células planctônicas e biofilmes de Candida albicans e espécies não-albicans de Candida spp
(Universidade Federal de Alfenas, 2020-02-20) Nascimento, Laís Stempniewski Do; Dias, Amanda Latercia Tranches; Menezes, Luciana Da Silva Ruiz; Ikegaki, Masaharu
Algumas espécies de Candida spp. apresentam importantes fatores associados à virulência, dentre eles destaca-se a formação de biofilmes, os quais podem estar associados a mudanças no perfil de sensibilidade dos isolados, aos antifúngicos disponíveis. Devido a esses fatores, fazse necessária a pesquisa de novas opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por Candida spp., destacando-se, assim, a importância da busca de bioativos em fontes naturais. As plantas do gênero Lavandula spp. são utilizadas em todo o mundo devido às suas propriedades terapêuticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar, in vitro, as atividades antifúngicas de Lavandula angustifolia Mill. e Lavandula dentata L. sobre isolados de Candida albicans e espécies não-albicans de Candida spp. cultivados em estado planctônico e na forma séssil, ou seja, biofilme. Primeiramente, realizou-se a caracterização fitoquímica, por cromatografia em camada delgada, dos extratos hidroetanólicos de folhas e flores de L. angustifolia e L. dentata e sugeriu-se a presença de saponinas, terpenos e flavonóides. Posteriormente, fez-se ensaio de difusão em ágar para triagem da atividade antifúngica dos extratos. Após, fez-se a avaliação da Concentração Inibitória de 50% e 90% (IC50 e IC90) do crescimento dos isolados, em que dos extratos hidroetanólicos de Lavandula spp. foram adicionados aos cultivos de Candida albicans, Candida krusei e Candida glabrata. L. angustifolia foi ativa em células planctônicas de C. krusei e C. glabrata: flores e folhas frescas em C. krusei, e folhas frescas em C. glabrata. L. dentata foi ativa em C. krusei em estado planctônico: flores e folhas frescas. Em biofilmes de C. krusei, o extrato de flores frescas de L. angustifolia causou redução da atividade metabólica das células e os extratos de flores e folhas frescas causaram redução da biomassa. Quanto à L. dentata, o extrato de flores frescas diminuiu a atividade metabólica das células e levou à redução de biomassa fúngica, enquanto o extrato de folhas frescas diminuiu a atividade metabólica das células. Em biofilmes de C. glabrata, o extrato de folhas frescas de L. angustifolia causou redução da biomassa fúngica. Não se observou atividade significativa dos extratos sobre C. albicans em estado planctônico e biofilme. Quanto ao teste de citotoxicidade, os maiores valores de concentração citotóxica para 50% das células (CC50): foram apresentados pelo extrato de folhas frescas de L. angustofolia, seguida pelo extrato de folhas frescas de L. dentata, fato que sugere que estes possam ser os extratos mais seguros para uso. Os demais extratos, apresentaram menores valores de CC50: flores frescas de L. angustifolia e flores frescas de L. dentata. Assim sendo, elegeu-se o extrato de folhas frescas de L. angustifolia para a continuidade das avaliações e o mesmo foi submetido à avaliação fitoquímica por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Através desta avaliação, foram detectadas as presenças de flavonoides e elagitaninos. Em relação à avaliação do efeito combinado entre o extrato de folhas frescas de L. angustifolia e antifúngicos de uso convencional em células planctônicas, observou-se efeito aditivo na combinação deste extrato com fluconazol contra C. krusei (FICI: 0,516) e C. glabrata (FICI: 0,625); quanto ao extrato combinado com caspofungina observou-se efeito indiferente contra C. krusei (FICI: 2,00) e efeito antagônico contra C. glabrata (FICI: 4,282). A interação do extrato de folhas frescas de L. angustifolia em biofilme mostrou-se indiferente para C. krusei (FICI fluconazol: 1,25; FICI anfotericina B: 1,125). Porém a interação do extrato com anfotericina B para C. glabrata mostrou-se aditiva (FICI: 0,503), podendo se tornar uma opção para combater biofilmes em formação. Não houve concentração fungicida mínima em nenhuma das situações (células planctônicas, biofilme e sinergismo) de nenhuma espécie de Candida avaliada.
Acesso aberto (Open Access)
Levantamento da diversidade genotípica de IGS1 rDNA de cinco espécies de trichosporon e sua relação com a emergência de resistência à antifúngicos, sítio de isolamento e dispersão geográfica mundial
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-08-31) Silva, Elaine Aparecida Da; Dias, Amanda Latercia Tranches; Sanson, Gerdine Ferreira De Oliveira; Silveira, Nelson José Freitas Da
Trichosporon spp.são fungos pertencentes ao filo Basidiomycota, classe Tremellomycetes e ordem Trichosporonales. São pleomórficos, crescendo como blastoconídios, pseudohifas, hifas verdadeiras e artroconídios. Trichosporon spp. abriga 20 espécies no gênero, das quais pelo menos nove são de importância clínica, sendo as mais relevantes: T. asahii, T. asteroides, T. faecale, T. inkin e T. ovoides. As espécies do gênero são identificadas pelo sequenciamento da região espaçadora intergênica IGS1 (Intergenic Spacer region) do rDNA que apresenta diversidade genotípica identificada em T.asahii e T. faecale. O objetivo deste trabalho foi realizar levantamento sistemático de sequências de IGS1 de cinco espécies de Trichosporon e de dados epidemiológicos para relacionar a emergência de resistência a antifúngicos aos genótipos dessas espécies. Para isso, foram pesquisadas sequências de IGS1 de T. asahii, T. asteroides, T. faecale, T. inkin e T. ovoides depositadas no NCBI- GenBank até 31/12/2019. Sendo realizada também, análise de datação dos eventos de radiação dos genótipos para compreensão da disperção e microevolução de cada espécie. Nas buscas, foram encontradas 496 sequências para T. asahii. Para as demais espécies, foram encontradas 39 sequências de T. asteroides, 29 de T. faecale, 39 de T. inkin e quatro sequências de T. ovoides. A análise haplotípica demonstrou a existência de 32 genótipos para T. asahii, 15 já descritos na literatura e 17 novos. Para as espécies T. asteroides e T. ovoides, foram encontradas quatro genótipos cada, identificados de forma inédita neste trabalho. T. faecale e T. inkin apresentaram seis genótipos cada, sendo que T. faecale confirmou dois genótipos já descritos na literatura e quatro identificados no presente trabalho. A distribuição geográfica revelou a presença dos isolados de T. asahii em 11 países, sendo eles: Argentina, Brasil, China, Estados Unidos da América (EUA), França, Grécia, Índia, Japão, México, Tunísia e Turquia, já as demais espécies foram prevalentes em sete países: Argentina, Brasil, China, Índia, Portugal, Suíça e Turquia, destacando predominância de todas as espécies no Brasil, com exceção de T. ovoides. Quanto à distribuição dos genótipos de T.asahii, G1 é prevalente no mundo, apresentando 207 sequências, seguido de G3, ambos presentes em nove dos 11 países, principalmente no Brasil e China. G4, com 89 sequências, foi prevalente na China, G7, com 31 sequências, foi prevalente no Brasil. Dos 17 novos genótipos, 13 foram isolados no Brasil, 1 na China, 1 na Grécia e 2 da Índia. Os principais sítios de isolamento foram: sangue (153), urina (123), micoses superficiais (63), vias respiratórias (45), outros sítios de origem humana ou sem sítios identificados (110). G1 foi dominante em todos os sítios, exceto em via respiratória, com maioria G4. Nas amostras de sangue, além de G1, foram encontrados G3, G4, G5 e G7; em urina, G1 e G3, G4, G5 e G7 e em micoses superficiais, G1, G3, G4 e G7. Os principais sítios de isolamento foram: sangue (12) e vias respiratórias (11) para T. asteroides; micoses superficiais (19) para T. faecale; micoses superficiais (18) para T. inkin. G1 foi prevalente no mundo para as espécies:T.asteroides,T. faecale eT. inkin, predominantes no Brasil. T. ovoides porém houve prevalência na Índia.Os resultados de concentração inibitária mínima de diferentes antifúngicos para T.asahii foram: FLZ: G3>G5>G4≈G7>G1>G16>G6, para AMB:G3>G16>G1>G4≈G5>G6>G7,VRZ:G3>G5>G4>G7>G1=G6>G6,ITZ:G3>G5>G4 >G7>G1>G16,CAS:G5≈G3>G7>G1>G6>G4, 5FC: G16>G5> G1>G3>G4>G7. AMB: G1>G3>G5>G2, FLZ: G2>G1>G3>G5, ITZ: G1>G1>G3>G5, VRZ: G1<G3=G5>G2. Para T. asteroides, AMB: G1>G2>G3, FLZ: G1>G3>G2, ITZ: G3> G2>G1, VRZ: G3>G2>G1.T.inkin, AMB:G4>G1>G3, FLZ: G4>G3>G1, ITZ: G4>G1>G3 eVRZ: G4>G3>G1. T. ovoides não apresentou dados de susceptibilidade à antifúngicos em literatura. Em conclusão, foi possível detectar genótipos novos de IGS1 rDNA nas cinco espécies de Trichosporon spp., sendo o Brasil, um dos países com maior número de isolados, tanto de sangue e urina para T. asahii, quanto de amostras respiratórias e micoses superficiais para espécies não-T. asahii, confirmando que voriconazol possui as menores CIMs e deve ser o fármaco de escolha para tratamento das tricosporonoses, independente do genótipo.
Acesso aberto (Open Access)
Perfil antifúngico e antibiofilme de Lactobacillus casei sobre Candida spp.
(Universidade Federal de Alfenas, 2022-02-25) Silva, Carolina Lima; Dias, Amanda Latercia Tranches; Menezes, Luciana Da Silva Ruiz; Rosalen, Pedro Luiz
Espécies do gênero Candida apresentam diversos fatores associados à virulência, dentre estes, destacam-se a capacidade de formação de biofilmes fúngicos monoespécie e multiespécie, além de biofilmes inter-reinos tais como os biofilmes formados por Candida spp. e bactérias. Lactobacillus spp. são espécies bacterianas que fazem parte do microbioma humano e há espécies que apresentam ação probiótica. Espécies de Lactobacillus já foram identificadas como agentes promissores para tratamento e/ou prevenção de infecções por Candida spp. Neste sentido, objetivamos em nossa pesquisa, a identificação da interferência, positiva ou negativa, de L. casei sobre o desenvolvimento de células planctônicas e biofilmes de Candida spp.. Biofilmes inter- reinos foram formados e a sensibilidade antifúngica, atividade metabólica e biomassa foram verificadas. Observou-se aumento no teor de biomassa dos biofilmes inter-reinos quando em comparação com o biofilme monoespécie de Candida spp.. L. casei, em estado planctônico, a partir da concentração de 5x10 6 células mL -1 foi capaz de reduzir em 61% a atividade metabólica de células planctônicas de C. albicans quando adicionados no momento de incubação e durante a fase exponencial de C. albicans. L. casei, em estado planctônico, foi capaz de diminuir em 36% a atividade metabólica de células planctônicas de C. krusei a partir da concentração de 5x10 5 células mL -1 . Adição de células planctônicas de L. casei ao biofilme de C. albicans na fase de maturação e ao biofilme de C. krusei no momento de adesão, a partir da concentração de 5x10 7 células mL -1 reduziu a atividade metabólica de Candida spp.. Biofilme pré-formado de L. casei foi capaz de diminuir a atividade metabólica de biofilme de C. albicans e C. krusei em 16% e 21% respectivamente. Ademais biofilme de L. casei reduziu em 24% a atividade metabólica de biofilme de C. albicans. Por fim, o antifúngico fluconazol, apresentou maior potencial antibiofilme sobre Candida spp. quando em interação destas com L. casei. Esses resultados demonstram as possibilidades de interações entre espécies fúngica e bacteriana, simulando muitas vezes, as interações que ocorrem no contexto do microbioma humano. Esses resultados mostram-se altamente promissores principalmente no que se refere à profilaxia e tratamento de infecções associadas à Candida spp.

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