Mestrado em Ciências Biológicas

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Acesso aberto (Open Access)
Avaliação da atividade antimicrobiana e da toxicidade do Phtalox® em modelos in vitro e in vivo de Galleria mellonella
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-07-28) Bruzadelli, Rafaela Franco Dias; Ikegaki, Masaharu; Murata, Ramiro Mendonça; Almeida, Patricia Paiva Corsetti De
A doença periodontal é uma condição em que ocorre a deterioração progressiva dos tecidos moles e duros que compõem o complexo periodontal. Essa deterioração é resultado de uma interação complexa entre comunidades microbianas disbióticas e respostas imunológicas exacerbadas nos tecidos gengivais e periodontais. No contexto dessa doença, o biofilme periodontopatogênico é uma comunidade de microrganismos composta por diversas gêneros e espécies bacterianos, como a Porphyromonas gingivalis e a Tannerella forsythia. O tratamento para a doença periodontal muitas vezes envolve o uso de antibióticos, e, portanto, há uma necessidade de pesquisas voltadas para o desenvolvimento de novos antibióticos capazes de inibir ou eliminar o biofilme presente. Nesse contexto, o Phtalox ® (PHT) surge como um potencial antimicrobiano. Trata-se de uma ferro-ftalocianina modificada com grupos carboxila em suas extremidades e ferro no centro, que exibe propriedades oxidantes, promovendo a geração contínua de oxigênio reativo na presença de oxigênio molecular. Neste estudo, foi realizado o teste de determinação da concentração inibitória mínima (CIM) utilizando bactérias sésseis. Adicionalmente, foi cultivado e tratado um biofilme subgengival de sete dias composto por 33 espécies bacterianas. A atividade metabólica e a composição microbiana do biofilme foram avaliadas por meio da técnica de hibridização DNA-DNA, conhecida como técnica Checkerboard. Para o teste de toxicidade e de atividade antimicrobiana in vivo foi utilizado o modelo de Galleria mellonella, pois é um método reconhecido pela Rede Nacional de Métodos Alternativos ao Uso de Animais (RENAMA), onde as larvas possuem resposta imune celular mediada por células fagocíticas que podem ser comparadas aos neutrófilos dos mamíferos. Os resultados obtidos no teste de CIM indicaram que o PHT não apresentou inibição frente aos microrganismos testados e nas condições do método. No entanto, o PHT na concentração de 10.000 μM demonstrou eficácia estatisticamente semelhante à Clorexidina 2.374 μM (CLX) na redução do biofilme multiespécie subgengival in vitro, inibindo o crescimento de patógenos-chave da doença. Os testes de toxicidade in vivo utilizando o modelo de G. mellonella demonstraram que o produto não é tóxico, mesmo em altas dosagens. Além disso, o PHT se mostrou tão eficaz quando a CLX para a sobrevivência das larvas infectadas com Staphylococcus aureus. Esses resultados destacam o potencial do Phtalox ® como uma alternativa promissora no combate à doença periodontal.
Acesso aberto (Open Access)
Bioprospecção e caracterização de fungos endofíticos produtores de compostos bioativos isolados de Dalbergia ecastaphyllum L. Taub
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-08-06) Pinto, Rayra Annara Da Fonseca Otacílio; Ikegaki, Masaharu; Florentino, Ligiane Aparecida; Dias, Amanda Latércia Tranches
Os metabólitos secundários de endófitos são conhecidos por suas atividades bioativas e utilização biotecnológica. A Dalbergia ecastaphyllum (L).Taub é a principal fonte da resina utilizada para a produção de própolis vermelha brasileira, produto com propriedades medicinais, seus endófitos constituem fontes atrativas para a bioprospecção de compostos biologicamente ativos. Este trabalho objetivou isolar fungos endofíticos de D.ecastaphyllum para avalia-los em ensaios biológicos, in vitro, de atividade amilolítica, antimicrobiana, antioxidante, antiproliferativa, determinação de compostos por Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) dos extratos brutos e caracterização morfológica dos microrganismos. Um total de 150 fungos endofíticos foi obtido através das folhas de D. ecastaphyllum coletadas em Canavieiras-BA. Foi estabelecido, pela primeira vez, um protocolo eficaz para a obtenção de fungos endofíticos para essa espécie vegetal. Os endófitos foram submetidos à triagem de atividade amilolítica e antimicrobiana pela metodologia do ágar em bloco, 12,67% foram capazes de sintetizar a enzima amilase in vitro e 23,33% apresentaram atividade antimicrobiana no método de triagem. Onze endófitos foram selecionados de acordo com o tamanho e especificidade das zonas de inibição na triagem, e foram submetidos à fermentação fúngica para obtenção de seus extratos brutos. Os extratos etanólicos dos endófitos foram avaliados pelo método de microdiluição em caldo contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras do gênero Candida spp. Todos os extratos apresentaram atividade antimicrobiana, principalmente contra bactérias da família Enterobacteriaceae. As concentrações inibitórias variaram de 50 µg/mL até 800 µg/mL. Os extratos foram avaliados em ensaio antioxidante de DPPH, no qual todos tiveram capacidade sequestrante de radicais livres com médias estatisticamente distintas, sendo três extratos mais ativos que o padrão sintético comercial Hidroxitolueno butilado. O ensaio de viabilidade celular por MTS de cinco extratos não mostrou diminuição significativa da proliferação celular em células tumorais MCF-7, A549 e Hep-G2. As análises por CLAE-FR indicaram que os metabólitos secundários produzidos pelos endófitos têm características polares, e a caracterização morfológica prévia pela técnica de microcultivo mostrou fungos com hifas hialinas, septadas e produção de ascósporos sugestivos do filo Ascomycota. Este constitui o mais completo levantamento da microbiota endofítica de D.ecastaphyllum presente na literatura, o primeiro relato de atividade antimicrobiana de seus endófitos, e a comprovação de seu potencial como fontes de substâncias bioativas de interesse biotecnológico.
Acesso aberto (Open Access)
Caracterização química e atividades biológicas da geoprópolis produzida por Melipona rufiventris
(Universidade Federal de Alfenas, 2019-12-16) Santini, Amanda Tristão; Ikegaki, Masaharu; Alencar, Severino Matias De; Rosalen, Pedro Luiz
Os produtos naturais são utilizados pelo homem na cura e prevenção de doenças desde tempos imemoriais. Dentre os produtos naturais mais utilizados no mundo podemos citar a geoprópolis que é caracterizada por substâncias resinosas produzidas em qualquer época do ano por abelhas nativas sem ferrão a partir de uma mistura de materiais coletados de várias partes das plantas às quais esses invertebrados adicionam ceras, pólen e solo. Apesar das propriedades farmacológicas desse produto serem conhecidas desde os tempos remotos, os estudos disponíveis na literatura ainda são escassos. As abelhas nativas sem ferrão são de grande importância na manutenção de ecossistemas e fonte de renda para comunidades locais de meliponicultores. Devido à escassez de pesquisas existentes e divulgadas com a geoprópolis produzida por Melipona rufiventris, este trabalho justifica-se pela necessidade em se avaliar a composição química e as propriedades antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória desse produto, a fim de elucidar possíveis usos futuros para o produto. Além disso, trabalhos relacionados à bioprospecção de produtos meliponícolas fortalecem a meliponicultura e manutenção das espécies de abelhas nativas. Para a avaliação da composição química e atividades biológicas da geoprópolis, a amostra foi coletada na região de Cabo Verde-MG no Meliponário Leite, e produziu-se o extrato etanólico da mesma. Foram realizadas análises químicas para investigar a composição dos extratos, empregando espectofotometria e cromatografia em camada delgada, além da determinação quantitativa dos compostos fenólicos e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (CLAE-FR). Para a determinação das atividades biológicas, a amostra foi submetida ao teste de toxicidade sistêmica com o modelo de Galeria mellonella para se avaliar as concentrações seguras a se utilizar. Posteriormente foram realizados ensaios in vitro para a determinação das atividades antimicrobiana e sinérgica, avaliando-se as concentrações inibitórias mínimas, concentrações microbicidas mínimas e a interação entre o extrato e o antimicrobiano comercial; antioxidante pelos métodos do sequestro de radicais livres DPPH e superóxido, bem como capacidade de absorção do radical peroxil; viabilidade celular determinada por MTS; e anti-inflamatória. Os resultados apontam a possível presença de compostos fenólicos, incluindo flavonoides, e terpenos na amostra. Já a análise por CLAE-FR mostra que o extrato apresenta composição complexa, porém não foi possível identificar com exatidão as principais substâncias químicas presentes no mesmo. O teste de atividade antimicrobiana mostrou que o extrato apresenta uma maior atividade contra bactérias gram-positivas, apresentando também uma atividade considerável contra bactérias multirresistentes isoladas de feridas complexas. O EEGP apresentou também atividade sinérgica em conjunto com os antimicrobianos comerciais amoxicilina e sulfametoxazol + trimetoprima. Para as análises de atividade anti-inflamatória, o extrato inibiu a ativação de NF-kB e a liberação de TNF-α em concentrações seguras. Apesar dessas atividades biológicas, o EEGP não apresentou atividade antiproliferativa pelo método do MTS. Ainda são necessárias análises mais refinadas para esclarecer a composição química do extrato, mas conclui-se que o mesmo apresenta compostos fenólicos e terpenos que podem ser moléculas responsáveis pelas atividades biológicas apresentadas.
Acesso aberto (Open Access)
Caracterização química e determinação da atividade antimicrobiana, antioxidante e antiinflamatória do extrato etanólico de geoprópolis de Melipona quadrifasciata por ensaios in vitro e in vivo em modelo de Galleria mellonella.
(Universidade Federal de Alfenas, 2023-06-16) Silva, Namuhell Oliveira Da; Ikegaki, Masaharu; Pereira, Ildinete Silva; Marques, Marcos José
A geoprópolis é um tipo de própolis produzida por espécies de abelhas sem ferrão, que consiste na mistura de resina, cera e solo. Apesar das propriedades farmacológicas deste produto serem conhecidas desde os tempos remotos, os estudos disponíveis na literatura ainda são escassos. As abelhas nativas sem ferrão são de grande importância na manutenção de ecossistemas e fonte de renda para comunidades locais de meliponicultores. Este trabalho tem como objetivo principal analisar a composição química e a atividade biológica da geoprópolis produzida pela abelha nativa sem ferrão da espécie Melipona quadrifasciata, bem como, implementar na UNIFAL-MG o modelo in vivo de Galleria mellonella para determinação da toxicidade e atividade antimicrobiana da geoprópolis. Para a avaliação da composição química e atividades biológicas da geoprópolis, a amostra foi coletada no município de Morretes-PR e, posteriormente, extraída em etanol 80% (v/v) para obtenção do extrato etanólico de geoprópolis- EEGP. Foram realizadas análises químicas para investigar a composição do extrato por , determinação quantitativa dos compostos fenólicos e determinação das atividades biológicas. A amostra foi submetida às análises de toxicidade sistêmica com o modelo de G. mellonella visando definir as concentrações seguras a se utilizar. Posteriormente foram realizados ensaios in vitro para a determinação das atividades anti-inflamatórias e antimicrobianas, avaliando-se as concentrações inibitórias mínimas, concentrações microbicidas mínimas e atividade antioxidante pelos métodos do sequestro de radicais livres DPPH, potencial redutor férrico FRAP e capacidade de redução do radical oxigênio ORAC. Como resultados verificou-se que o teor de compostos fenólicos totais do EEGP foi de 23,60±0,22 mg GAE/g de extrato. A capacidade antioxidante da geoprópolis na redução do radical DPPH foi de 54,79± 1,64 μmol TEAC/g de extrato, o teste FRAP mostrou um resultado de 2467,33±223,45 μmol SF/g extrato, e no ORAC a capacidade do EEGP foi de 0,57±0,03 μmol TEAC/g. O EEGP apresentou capacidade antioxidante de compostos isolados quanto à redução do radical ABTS·+ on-line. O ensaio de atividade antimicrobiana mostrou que o extrato apresenta uma maior atividade contra bactérias gram-positivas. O extrato não apresentou toxicidade no modelo in vivo utilizado. Além dos resultados científicos que poderão impactar na no conhecimento dessa área, pudemos estruturar a produção de larvas de G. mellonella, e a implementação de metodologias para a determinação de toxicidade e da atividade antimicrobiana in vivo que permitirá assim, vislumbrar a possibilidade de publicações em periódicos de maior impacto, bem como estabelecer parcerias com outros grupos de pesquisa dentro e fora da instituição, otimizando recursos públicos, aumentando a produtividade científica e a visibilidade da instituição.
Acesso aberto (Open Access)
Estudo da atividade biológica do produto da fermentação do fungo endofítico Gibberella moniliformis, proveniente do mangue brasileiro
(Universidade Federal de Alfenas, 2018-07-13) Reis, Ana Luísa Lopes Ernesto; Ikegaki, Masaharu; Lecava, Paulo Teixeira; Ariosa, Marília Caixeta Franco
A busca por novos compostos para uso na medicina, agricultura e indústria está em contínuo crescimento, e os produtos naturais constituem a estratégia de maior sucesso para a descoberta de novas moléculas. Entre os diversos produtos naturais existentes considera-se os fungos endofíticos de mangues uma fonte valiosa para a descoberta de novas substâncias de interesse terapêutico e biotecnológico, pois oferecem uma diversidade incontável de estruturas químicas. Tendo em vista o potencial bioativo destes micro-organismos, o objetivo deste trabalho consistiu em avaliar a atividade biológica e a composição química da fração butanólica do extrato proveniente da fermentação do fungo endofítico Gibberella moniliformis 99(3) visando identificar novos metabólitos bioativos. O endófito, isolado da planta de mangue Laguncularia racemosa, foi submetido ao processo de fermentação em caldo Czapek e posteriormente o caldo fermentado foi particionado com diferentes solventes gerando a fração butanólica (FBuOH). A composição química da fração FBuOH foi analisada por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-DAD), bem como foi determinado seu conteúdo de fenólicos totais (15,85 mg GAE/g). O estudo cromatográfico da fração FBuOH sugeriu a presença de grupos cromóforos (revelados por luz UV 254 nm), terpenos, saponinas e flavonoides (positivos ao anisaldeído sulfúrico), alcaloides (reativos a Dragendorff) e aminas primárias (positivos a ninhidrina). Foi investigado o potencial biológico da fração FBuOH por meio de diferentes ensaios in vitro. Nos ensaios antimicrobianos foram avaliadas a concentração inibitória mínima (CIM) e microbicida mínima (CMM) contra diferentes micro-organismos, sendo que a fração FBuOH evidenciou forte potencial antifúngico contra Candida albicans ATCC 10231, apresentando CIM de 25-50 μg/mL e CMM de 50 μg/mL, moderada atividade contra Escherichia coli ATCC 25922 (CIM: 100-200 μg/mL e CMM > 400 μg/mL) e foi inativa frente à Staphylococcus aureus ATCC 6538 nas concentrações testadas. Verificou-se efeito sinérgico na associação da fração FBuOH com fluconazol (ICIF = 0,375), com potencialização em 8 vezes da ação do fármaco contra C. albicans. A atividade antioxidante da fração FBuOH foi avaliada pelos métodos DPPH, ABTS, ORAC e FRAP, com resultados de 39,03; 152,16; 213,72 μmol de Trolox/g de fração e 182,28 μmol de Fe2+/g, respectivamente, e também por HPLC-ABTS•+ on-line, não evidenciando compostos com atividade expressiva. A atividade antiproliferativa foi testada pelo método sulforadamina B (SRB) frente a dez linhagens tumorais humanas e uma linhagem não tumoral e verificou-se que FBuOH não inibiu a proliferação celular de nenhuma das linhagens avaliadas nas concentrações testadas (TGI > 250 g/mL), sendo relevante destacar que a mesma apresentou TGI > 250 g/mL também para a linhagem não tumoral HaCaT (queratinócito). A fração FBuOH não apresentou atividade contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis nas concentrações testadas (IC50 > 100 g/mL). No ensaio de citotoxicidade a concentração citotóxica da fração FBuOH que inibiu 50% de células Vero foi de 449 g/mL, apresentando índice de seletividade de 8,98. Conclui-se que o fungo G. moniliformis 99(3) é promissor na produção de compostos antifúngicos, incentivando a continuidade de estudos com a fração FBuOH tanto para um possível isolamento do composto responsável pela atividade evidenciada, quanto para futuros testes in vivo.
Acesso aberto (Open Access)
Safety evaluation of Brazilian red propolis uses during pregnancy and offspring development in a mouse model.
(Universidade Federal de Alfenas, 2021-02-12) Carlstrom, Paulo Fernando; Ikegaki, Masaharu; Salles, Évila Da Silva Lopes; Rosalen, Pedro Luiz
Os padrões de saúde e doença são influenciados em diferentes estágios do curso de vida por uma combinação de fatores genéticos, epigenéticos e ambientais. A própolis vermelha brasileira (BRP) é um tipo de própolis com grande potencial na terapia de saúde. No entanto, não há estudos avaliando o uso seguro e a toxicidade do desenvolvimento dessa própolis. O objetivo deste estudo é investigar a segurança do uso de BRP na gravidez e no desenvolvimento da prole e da vida adulta em um modelo animal. Os camundongos prenhes foram divididos em quatro grupos, dois grupos controle (C, Tween 80 1%) e dois grupos BRP (200mg/kg/dia por gavagem), administrados por 10 e 20 dias. Os animais foram submetidos à eutanásia, sendo realizadas análises relacionadas ao ganho de peso, taxa de implantação e natalidade, nível sérico de citocinas (IL-1ß, IL-6 e IL-10), morfológicas e estereológicas do uNK. Os grupos de descendentes (F1C e F1BRP) foram obtidos tratando-se as fêmeas durante a gravidez. Os filhotes foram analisados quanto ao desenvolvimento físico e neurológico por 30 dias após o nascimento e comportamento na idade adulta (atividade locomotora e memória). O consumo de BRP alterou significativamente o número de subtipos de uNK, com diminuição do subtipo III (8,3 células/AT) concomitante a um aumento do subtipo IV (5,31 células/AT) na região 2 do local de implantação no 10º gd no grupo de mães, mas sem alterar o ganho de peso, as taxas de implantação e natalidade e o nível sérico de citocinas. Na geração F1, não foram observadas malformações congênitas, distúrbios nos parâmetros de desenvolvimento físico e neurológico e alterações comportamentais em filhos adultos. Nossos dados indicam que o BRP é seguro para uso durante o período gestacional de camundongos e não causa alterações na prole por meio da programação fetal, apresentando potencial para futuros ensaios pré-clínicos.

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